无花果拟盘多毛孢中pestheic acid生物合成途径的研究以及产黄青霉中pcvA基因的功能研究

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Pestheic acid是分离自无花果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis fici CGMCC3.15140)的二苯醚类化合物。无花果拟盘多毛孢能够产生一系列具有独特骨架和良好生物活性的含氯原子的pupukeanane衍生物chloropupukeananes。Pestheicacid被推测是chloropupukeananes可能的生物合成前体。我们利用根瘤农杆菌介导的转化技术,实现了无花果拟盘多毛孢的遗传转化,这为开展基因功能研究提供了基础。根据pestheic acid的结构特点以及其可能的合成途径,从无花果拟盘多毛孢的基因组中筛选到一个pestheic acid可能的生物合成基因簇。所推测基因簇共有16个编码基因,其中包括一个非还原型聚酮合酶编码基因ptaA。对此聚酮合酶编码基因进行敲除后,突变株中pestheic acid不再产生,从而证实了所推测基因簇为pestheic acid生物合成基因簇。这是真菌中第一个被实验验证的二苯醚类化合物的生物合成基因簇。为了阐明pestheic acid的生物合成途径,我们构建了基因簇中各编码基因的阻断突变株,并检测了突变株中中间产物的积累情况。通过E.coli异源表达了基因簇中的卤化酶基因ptaM并纯化了相应蛋白,在体外证实了其催化功能及底物的特异性。在上述结果的基础上,我们初步揭示了pestheic acid的生物合成途径。  Rab蛋白是一类属于Ras蛋白超家族的小分子G蛋白(small G-protein orsmall GTPase),研究表明它们参与了细胞内的囊泡(vesicles)运输过程,对真菌的正常生长发育具有重要作用。我们以产黄青霉(Penicillum chrysogenumCGMCC3.5129)作为研究材料,克隆得到Rab GTPase编码基因pcvA。序列分析结果显示,pcvA基因包含五个内含子。野生型菌株中pcvA的转录谱分析发现,其在菌体的生长过程中呈组成型表达。在产黄青霉体内对pcvA进行过量表达,可以促进囊泡向液泡的融合,同时发现青霉素的产量显著降低。这一结果表明液泡形成相关基因pcvA参与了青霉素的产生。另外,pcvA的高表达菌株的产孢能力明显降低,并且所产生分生孢子的抗热激能力明显下降。
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