背景与目的炭黑是指在燃料发生不完全燃烧时的产物,目前已被列入国际癌症研究机构组织的2B类致癌物质中。炭黑颗粒在药理学中的毒性破坏作用力与它们颗粒的尺寸大小紧密相关。与传统的微米级炭黑颗粒环境化学物相比,纳米级的炭黑颗粒所诱导的细胞受到损伤较为严重。研究证据表明炭黑纳米颗粒不仅可以引起细胞毒性、加重人类呼吸系统疾病,甚至可以造成DNA链损伤。环状RNA是非编码RNA的研究热点,大量研究表明,在化学物暴露所致机体健康效应中,环状RNA发挥重要调控功能。因此探讨circ RNA在炭黑纳米颗粒致DNA损伤机制中的作用,可以从表观遗传学层面更深入地阐述并揭示炭黑纳米颗粒引起的致病机制。建立接近环境实际暴露水平的炭黑纳米颗粒致呼吸道上皮细胞DNA损伤模型,寻找功能circ RNA并探讨其在炭黑纳米颗粒致人呼吸道上皮细胞DNA损伤中的分子机制。方法采用TEM对炭黑纳米的颗粒物表征进行鉴定。根据颗粒物实际暴露阈值、颗粒物在肺内沉积的相关文章以及MPPD软件模型等数据进行了折算,确定了体外细胞模型及体内动物模型构建的暴露剂量。选择16HBE、BEAS-2B细胞和BALB/c小鼠作为研究对象,体外实验构建了炭黑纳米颗粒导致DNA损伤的模型,通过CCK-8、LDH和ROS实验检测细胞的活力及氧化应激水平。通过ELISA、Western Blot、中性彗星实验来检测8-OHd G、γ-H2AX、DNA双链断裂等DNA损伤指标。体内实验中运用Western blot和q-PCR,评估炭黑纳米颗粒暴露小鼠肺部DNA损伤发生情况。通过高通量测序结合q-PCR挑选差异circ RNA。构建circ RNA干扰、过表达的研究体系,联合炭黑纳米颗粒暴露,通过流式细胞术、ELISA、Western Blot、免疫荧光、中性彗星实验等方法进行实验,检测到circ RNA005962表达改变对人支气管上皮细胞的细胞周期、ROS、8-OHd G及γ-H2AX等DNA损伤指标的影响。通过RNA pulldown实验确定circ RNA005962特异性结合蛋白,并在联合炭黑纳米颗粒暴露下,通过Western Blot及q-PCR对三者之间的互作关系进行验证。结果炭黑纳米颗粒在溶液中为纳米粒径,DLS为258.84±3.34nm,Zeta电位为-57.54±0.44。体外实验结果显示,炭黑纳米颗粒可以抑制细胞活力、诱导细胞ROS水平升高及DNA氧化损伤发生,且炭黑纳米颗粒引起的DNA损伤水平随染毒浓度的增加而升高。体内实验结果表明,无论在低暴露组还是在高暴露组,炭黑纳米颗粒均能引起小鼠DNA损伤发生,高暴露组DNA损伤水平更为严重。circ RNA005962在炭黑纳米颗粒暴露组中呈现高表达。circ RNA005962干扰联合炭黑纳米颗粒暴露后,DNA损伤水平较对照组升高;过表达circ RNA005962联合炭黑纳米颗粒暴露,DNA损伤水平较对照组降低,表明circ RNA005962在炭黑纳米颗粒致支气管上皮细胞DNA损伤反应中发挥调控作用。RNA pulldown实验证明circ RNA005962可与RNA结合蛋白FUS直接结合,并受FUS正向调控;circ RNA005962可结合DNA修复蛋白LIG4。干扰、过表达circ RNA005962后联合炭黑纳米颗粒暴露后,circ RNA005962可正向调控LIG4水平,进一步证实circ RNA005962在DNA损伤过程中发挥调控功能。结论1、CBNPs可以引起人支气管上皮细胞以及小鼠肺部的DNA损伤,在此过程中circ RNA005962发挥促修复基因的功能。2、在CBNPs致人支气管上皮细胞DNA损伤过程中,circ RNA005962与FUS直接结合并受其正向调控;同时circ RNA005962与LIG4直接结合并正向调控其表达,进而调控DNA损伤。