黄酮类化合物是广泛分布于植物体的一大类化合物。目前不断有文献报道从黄酮类化合物中筛选出了一些具有较强抗肿瘤活性的先导化合物，如槲皮素、葛根黄酮、杨梅黄素、蛇葡萄素等，其中金雀异黄素已经被开发上市(即金转停)。随着研究工作的深入，黄酮类化合物有望发展成为新一代的抗肿瘤药物。蛇葡萄素(AMP)，是从粤蛇葡萄或显齿蛇葡萄中提取的小分子黄酮类化合物。经过本实验室多年来的抗肿瘤实验研究，发现蛇葡萄素在体外对多种人肿瘤细胞株有显著的生长抑制作用。对C57BL/6小鼠B16黑色素瘤有抑瘤作用。对BALB/C裸鼠移植性人肺癌GLC-82和人肝癌Bel-7402瘤有一定的抑制作用。经研究也发现，蛇葡萄素对HL-60细胞及K562细胞有促进凋亡的作用，对Bel-7402细胞分泌的VEGF、bFGF均有抑制作用。 肝细胞癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。在我国，肝癌的发病率很高，死亡率占恶性肿瘤的第二位，已成为威胁我国人民生命健康的主要杀手之一。目前，肝癌的治疗方法临床疗效并不明显。近年来，越来越多的证据证明肝癌的发生、发展与肝癌细胞凋亡受阻有关。因此，寻找能够启动细胞凋亡的高效特异抗肝癌药物将为肝癌治疗提供一个新的策略。 目的：本课题拟以体外培养的人肝癌细胞株Bel-7402为模型，以黄酮类化合物中的蛇葡萄素为受试药物，利用细胞生物学和分子生物学的方法，研究蛇葡萄素对Bel．7402细胞生长增殖和凋亡的影响及其可能机制。其意义是探讨蛇葡萄素抗肿瘤作用的机制，为将蛇葡萄素开发成为新的抗肿瘤药物提供研究资料和实验基础。 方法:1.常规培养人肝癌Bel-7402细胞株，以1.56 mg/L、3.12 mg/L、6.25 mg/L、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L 8个浓度的AMP分别作用24 h、48 h和72 h，以不加AMP组为对照组，MTT法检测细胞增殖抑制率，计算半数抑制浓度(IC50)值，分析是否具有时间和浓度依赖性。 2.倒置显微镜下观察正常细胞的生长情况，经25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的AMP作用48 h后观察细胞的生长状态和形态变化。 3.Hoechst33342荧光染色观察25 medL、50 mg/L、100 mg/L AMP作用48 h细胞核的形态学改变。 4.琼脂糖凝胶电泳分析25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L AMP作用48 h、50 mg/LAMP作用24 h、48 h和72 h后的细胞DNA变化。 5.流式细胞仪检测细胞凋亡率。 6.为探讨AMP诱导Bel-7402细胞凋亡的分子机制，应用Western blot检测25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L AMP作用48 h easpase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表达情况。 结果: 1.AMP对Bel-7402细胞的生长有显著的增殖抑制作用，呈浓度和时间依赖性。AMP浓度为1.56 mgL/3.12 mg/L、6.25 mg/L、12.5 me/L、25 me/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L，作用24 h，抑制率分别为(-5.19±6.18)％、(-0.73+2.50)％、(3.54±3.45)％、(9.35±3.78)％、(24.85±7.48)％、(37.26±6.60)％、(48.47±6.09)％、(57.88±2.98)％；作用48 h，抑制率分别为(9.99±2.24)％、 (12.02±2.11)％、 (17.67±6.16)％、(38.77±4.54)％、(47.23±3.35)％、 (57.10±4.11)％、(68.24±2.96)％、(75.85±4.02)％；作用72 h，抑制率分别为(12.49±2.84)％、(19.50±4.93)％、(35.81±5.01)％、(50.76±8.75)％、(63.12±7.65)％、(73.50±3.99)％、(81.36±3.96)％、(88.14±4.53)％。24 h、48 h、72 h的IC50值分别是(89.64±16.12)meCL、(36.15±6.51)mg/L、(15.29±3.04)mg/L。48 h、72 h的IC50值与24 h小时的IC50值相比差异有显著统计学意义(P<0.05)。 2.倒置显微镜下观察，正常培养的Bel-7402细胞，接种24 h后，贴壁生长，呈多边形或梭形，轮廓清晰，胞质均匀透明，细胞间结构紧密，生长旺盛。48 h对照组，细胞增殖旺盛。25 mg/LAMP作用48 h后可见细胞间隙增宽，部分细胞逐渐变圆，体积变小，折光性减弱，细胞变粗糙，内可见颗粒状堆积物；50 mg/LAMP作用48 h后，有少量细胞自瓶壁脱落、崩解死亡，悬浮于培养液中。随药物浓度增大和作用时间的延长，细胞生长明显被抑制。 3.经Hoechst33342染色后于荧光显微镜下观察，对照组细胞呈均匀蓝色荧光，细胞膜完整，胞质丰富饱满，细胞核呈规则的椭圆形，核内物质均匀分布。50 mg/LAMP作用48 h后，部分细胞的细胞膜皱缩，细胞核浓聚，并可见大小不等、似圆形或花瓣状的凋亡小体。 4.对照组细胞DNA电泳后在上样孔附近出现一条大分子条带。50 mg/L AMP作用24 h，与对照组相比未见明显改变；50 mg/LAMP作用48 h、72 h后，可见间隔为180 bp左右的数条条带，呈现出凋亡细胞典型的DNA ladder。25 mg/L、50 mg/L、100 mg/LAMP作用48 h后均出现明显的DNA ladder。 5.Bel-7402细胞经50 mg/LAMP分别作用24 h、48 h和72 h后，各实验组均出现sub-G1峰，细胞凋亡率分别为(5.9±0.3)％、 (23.3±3.6)％、 (33.5±1.9)％，随着AMP作用时间的增加，细胞凋亡率逐渐升高，对照组(1.6±0.5)％没有明显的凋亡峰。各给药组同对照组比较，差别有统计学意义(P<0.05)，各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。Bel-7402细胞经浓度为25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的AMP作用48h后，各实验组均出现典型sub-G1峰，细胞凋亡率分别为(14.9±0.7)％、(23.3±3.6)％、 (37.2±2.2)％，随着药物浓度的增加，细胞凋亡率逐渐升高，对NN(0.9±0.2)％没有明显的凋亡峰。各给药组同对照组比较，差别有统计学意义(P<0.05)，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。 6.经Western blot检测，随着AMP浓度的增加，pro-caspase-3蛋白表达量逐渐降低，Bcl-2蛋白表达量逐渐降低，Bax蛋白表达量逐渐增加，呈明显的浓度依赖性(P<0.05)。结果表明caspase-3被激活，Bcl-2蛋白表达被下调，Bax蛋白表达被上调。 结论: AMP能诱导体外培养的人肝癌Bel-7402细胞凋亡，其作用具有时间和浓度依赖性。下调Bcl-2蛋白、上调Bax蛋白表达，活化caspase-3可/可能是AMP诱导Bel-7402细胞凋亡的机制之一。