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目的：探讨三种分型方法(多位点序列分型、PCR-核糖体分型、多位点可变数目串联重复序列分型)的方案是否适合我国艰难梭菌的分析,了解我国菌株是以何种基因型为主及其基因多态性的分布情况,并揭示不同地区和不同宿主人群来源菌株的遗传分支情况及其之间的联系,为我国菌株的起源及进化提供线索;建立起三种分子分型的平台,为我国艰难梭菌的感染分析提供技术支持。
方法：①收集来自北京、广州和山东的104株艰难梭菌及一株强毒株UK-l。②选用25株菌对多位点序列分型国际现有的两种方案(Lemmes和Griffths)的基因位点进行扩增后双向测序,之后采用START系统对这些位点进行多态性、非同义突变与同义突变的比值等分析,判断何种方案更适合我们菌株的分型,并采用该方法对104株菌进行研究:采用MEGA5基于菌株7个位点的复合序列绘制邻接树,进行遗传分支的分析;采用eburst Version3基于等位基因谱进行Burst分析,了解其种群结构。③比较基于凝胶电泳的PCR-核糖体分型和基于毛细管电泳的PCR-核糖体分型,并采用后者对104株菌进行分型,采用Bionumerics软件对其进行聚类分析。④采用A6Cd、B7Cd、C6cd、E7Cd、F3Cd、GSCd、H9Cd7个VNTR位点对104株菌进行基于毛细管电泳及扩增测序相结合的多位点可变数目串联重复序列分型研究,采用Bionumerics软件对其进行聚类分析。
结果：①Griffihs的方案更适合我们菌株的分型分析。②104株菌进行MLST分型,共产生22个ST型,其中STs117,118,119和129是本研究新发现的ST型;ST37是优势型别。③基因型别与地区和宿主人群来源之间不存在某种相关性,而与毒素基因之间存在一定的相关性,ST37型的菌株全是A-B+;包括4个新的ST型在内的大部分的菌株由于高的保守性形成同一个分支,而ST37及ST5各自形成独立的分支;没有形成区域特异或宿主人群来源特异的分支,也没有形成区域特异或宿主人群来源特异的克隆群。④基于毛细管电泳的核糖体分型比基于凝胶电泳的核糖体分型操作更为方便,产生的结果客观、重复性高,便于实验室间数据的交换。⑤毛细管核糖体分型聚类分析,按照100%的相似度104株菌分成52个型别,其中CN_R11是优势型别,且全是A-B+的菌株。⑥结合扫描和测序,对采用的多位点可变数目串联重复序列分型方案进行了分析,发现这些位点适合现有菌株的分析研究分型力为100%。按照70%的相似度,104株菌分为54个型别,其中CNM32和CNM36是菌株数最多的两个型别;根据聚类结果,得到与毒素相关的克隆群,CNM32到CNM36全是A-B+的菌株;位点G8Cd的扩增产物在所有ST37(A-B+)的菌株中均大于400bp。
结论：这是我国第一次对艰难梭菌进行系统的分型分析,对我国艰难梭菌的种群结构及基因多态性的分布有了初步的认识;建立起了我国三种分子分型的平台,对于局部地区艰难梭菌感染暴发的研究有着重要的价值,也将对全球范围内艰难梭菌感染的预防控制起着重要的作用。