近年来,随着经济和交通运输业的发展,颅脑损伤发生率逐年增加,资料统计显示颅脑损伤占全身外伤的第2位,但死亡率和致残率均位居首位,尤其是重型颅脑损伤患者,死亡率和致残率居高不下,总死亡率一直保持在30%～50%左右。虽然随着国内在颅脑创伤基础及临床防治研究的不断深入,患者的救治效果显著提高,致死及致残率有所降低。但是,颅脑外伤领域内仍存在许多尚待进一步研究解决的课题,特别是创伤性脑水肿、线粒体功能障碍、迟发性神经元损伤等问题。因此,深入研究颅脑外伤后各种病理生理变化,不断提升和改善颅脑外伤的规范化救治措施,是神经外科医生在本世纪的最重要任务之一。创伤性脑水肿是重型颅脑创伤后最重要的继发性病理和生理反应,其分为血管源性脑水肿和细胞毒性脑水肿、渗透压性脑水肿、间质性脑水肿四类；创伤性脑水肿的发生机制十分复杂,在发生、发展过程中,各种因素相互影响,共同作用。中枢神经系统脑外伤引起的应激和反射的变化,是脑水肿的起始因素；神经细胞和微血管内皮细胞钙超载在微循环障碍、脑缺血与缺氧等一系列继发性病理变化中起着关键作用。迟发性神经元损伤是颅脑损伤研究的重点和难点,包括神经元变性坏死和凋亡等类型。我们期望在神经元未发生不可逆损伤前,阻断其发病过程,使得部分神经元能恢复正常结果和功能。最近研究表明,细胞凋亡和自噬参与了重型颅脑损伤后神经细胞的死亡和功能丧失。神经元的凋亡在重型颅脑外伤的病理生理学方面具有重要意义。凋亡,Ⅰ型程序性细胞死亡,依赖于caspase参与,具有染色体浓缩,细胞皱缩,DNA片段化和凋亡小体形成等特点,其细胞的残骸最终被巨噬细胞清除。自噬性细胞死亡,Ⅱ型程序性细胞死亡,其特征是自噬体的形成,不依赖于caspase的参与,自噬体及其内部组件是通过自身的酶系统消化吸收的。它是高度保守的,它是真核细胞的自我保护机制。自噬是近年来分子生物学研究的一个热门话题。经研究证实,二者在功能上存在联系,自噬为凋亡所需,自噬通常先于凋亡,进而启动凋亡；自噬抑制凋亡,保护细胞：自噬可保护细胞免于发生凋亡和坏死；自噬可以向凋亡转化,共同促进细胞死亡。然而,对于重型颅脑损伤后,神经元自噬作用的研究还鲜有报道。但是,许多文献认为,自噬作用在许多神经退行性疾病中具有神经保护的作用,包括在帕金森病和阿尔茨海默病的；自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)可以衰减神经元死亡后的缺血性损伤；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)可以致敏细胞缺氧损伤。总之,自噬可能为重型颅脑损伤的救治提供一种有前景的治疗策略。17-烯丙胺基-17-脱甲氧基格尔德霉素(17-AAG)是格尔德霉素的衍生物,毒性更小而热休克蛋白90(HSP 90)的抑制作用更强,是最早通过临床Ⅰ期试验的热休克蛋白90抑制剂,目前正在进行Ⅲ期临床实验。其中,热休克蛋白是机体在应激(缺氧、外伤、病毒感染、紫外线照射等)状态下合成的一组蛋白质分子,故又称为应激蛋白。它在生物进化过程中是高度保守的,并在原核及真核生物中广泛存在。热休克蛋白不仅是一种重要的分子伴侣蛋白,而且也是一种细胞应激反应的生物标志物。热休克蛋白在机体内主要功能是参与维持其客户蛋白的正确折叠,使蛋白能够形成生理功能所需的构象,从而调控其在蛋白合成与降解平衡之间的作用,以及发挥其在蛋白定位中的作用。其中,HSP90家族是当前研究的热点和重点,得到了广泛的关注。HSP90在细胞内含量丰富,占总量的1%～2%。越来越多的研究表明,HSP90抑制剂可以阻止细胞生长和转移信号通路中的多个位点,降低单一抑制某一通路时细胞容易产生耐药性风险。Hsp90抑制剂的寻找正成为时下的研究热点。17-烯丙胺基-17-脱甲氧基格尔德霉素(17-AAG)是人类成功研制的HSP90抑制剂。有研究表明,17-AAG通过抗炎机制在阿尔茨海默氏病的动物模型,肌萎缩侧索硬化,局灶性脑缺血,脊髓损伤和TBI等疾病上发挥着神经保护作用；特别是在大鼠sTBI模型,17-AAG可以减少出血的神经保护作用,改善神经行为,但其是否能够调节神经细胞自噬的作用一直没有研究。实验目的：本实验通过建立大鼠重型颅脑损伤模型,探讨17-AAG是否可以减轻脑水肿,抑制迟发性神经元损伤,激活神经元自噬功能,从而抑制神经元凋亡,改善神经元的存活。此外,我们通过自噬诱导剂雷帕霉素及自噬抑制剂3-MA,诱导或抑制脑皮质细胞自噬相关蛋白的表达,从而探讨自噬在神经保护中的重要作用。实验方法：1.采用改进的Feeney’s自由落体硬膜外撞击方法制备大鼠的重型颅脑损伤动物模型；2.应用17-烯丙胺基-17-脱甲氧基格尔德霉素、3-甲基腺嘌呤、雷帕霉素等药物处理大鼠的重型颅脑损伤模型；3.湿干称重法检测大鼠的脑组织含水量,并对不同药物处理的大鼠脑组织含水量进行对比；4.对重型颅脑损伤24小时后的大鼠,应用大鼠神经功能缺损评分进行评分,并对不同药物处理的大鼠评分情况进行对比；5.使用苏木精-伊红(H&E)染色方法,对每1毫米的大鼠脑皮质染色区进行生存和死亡的神经元计数,并对不同药物处理的大鼠皮层神经元存活率进行对比;6.应用Western blot的方法,检测重型颅脑损伤大鼠24小时后脑皮层自噬相关蛋白的表达情况,并对不同药物处理的大鼠皮层神经元自噬相关蛋白表达情况进行对比；7.应用Western blot和免疫组化染色的方法,使用anti-caspase 3抗体作为标记,检测大鼠皮层神经元的细胞凋亡水平,并对不同药物处理的大鼠皮层神经元凋亡情况以及caspase 3表达情况进行对比；实验结果：1.成功建立大鼠重型颅脑损伤动物模型；2.湿干重法评价大鼠创伤后24小时脑水肿情况：17-AAG组与对照组比较,脑水肿含量明显减弱；而3-MA治疗组的水分含量明显高于17-AAG组；相反,在RAPA组,脑水含量显著降低。3.大鼠颅脑创伤24小时后,17-AAG组较sTBI对照组神经功能缺损明显减少,而治疗干预组神经功能缺损相比17-AAG组升高。4.在对照组中神经元存活率为43.45±4.89%,而17-AAG组存活率为88.67±6.46%在存活。3-MA干预组神经元存活率为(51.24±2.19%),较17-AAG组显著降低。5.与对照组相比,17-AAG组中Beclin-1和LC3Ⅱ的蛋白表达显着升高。而在3-MA组中Beclin-1LC3Ⅱ的蛋白表现刚好相反。而与17-AAG组相比,雷帕霉素组显著增强了LC3Ⅱ的表达。6.与对照组相比,17-AAG组可以显著抑制Caspase 3表达；而3-MA组可以上调Caspase 3表达,而雷帕霉素组结果相反。实验结论：1.17-AAG (10mg/kg)能明显减弱脑水肿的程度；雷帕霉素诱导自噬反应后,脑组织水肿的程度进一步降低；而3-MA抑制自噬反应后,加重了脑水肿情况,并且脑水肿情况还超过了17-AAG治疗干预组。2.通过大鼠皮层神经元H&E染色及大鼠行为功能评价,显示17-AAG治疗干预组减少了大鼠皮层神经元的损伤和死亡,改善大鼠了运动功能的；而同样在应用自噬诱导剂或抑制剂后,减轻或加重了颅脑损伤,3.与对照组相比,17-AAG组中Beclin-1和LC3Ⅱ的蛋白表达显着升高。与17-AAG组相比,雷帕霉素组显著增强了LC3Ⅱ的表达。而在3-MA组中Beclin-1和LC3Ⅱ的蛋白表现刚好相反。17-AAG可以诱导重型颅脑损伤后大鼠皮层神经元的自噬反应,并且这个过程中,受到自噬诱导剂及抑制剂的调节。4.17-AAG治疗干预组中大鼠皮层神经元的Caspase 3表达下调,细胞凋亡水平明显降低,从而抑制细胞死亡；雷帕霉素在此基础上,进一步降低了大鼠皮层神经元Caspase 3表达和细胞凋亡水平,而3-MA组可以上调Caspase 3表达。实验结果进一步说明了,17-AAG不仅引起Caspase 3表达下调,从而抑制细胞死亡,而且有效的诱导神经元自噬反应。总之,大鼠重型颅脑损伤后,17-AAG可以减轻大鼠脑组织水肿,减少神经元的死亡,改善大鼠运动功能的恢复。并且通过对于大鼠神经元凋亡与自噬反应的研究,我们进一步发现17-AAG通过诱导神经元自噬抑制重型颅脑损伤后Caspase 3的活化而实现其神经保护作用。不仅如此,本实验通过研究17-AAG的神经保护作用及其机制的探索,为神经系统疾病特别是重型颅脑外伤的治疗提供了新的思路。