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目的非酒精性脂肪性肝病是世界范围内的流行病,包括单纯性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎。而非酒精性脂肪性肝炎在终末期可以发展成为肝硬化甚至肝癌。同时,非酒精性脂肪性肝炎也是肝移植的主要原因之一。然而当下对非酒精性脂肪性肝病的治疗还停留在生活方式治疗的阶段,药物治疗仍处于二三期临床试验阶段,目前尚无针对NASH的特效药物。鉴于NASH给家庭和国家带来的巨大负担,寻找治疗NASH的新方法或靶点,是当下医学研究中的重要议题。以往研究表明蛋白激酶ASK1对NASH的炎症激活,脂质累积,纤维化的发生发挥重要的调控作用。SCF复合体是一种泛素连接酶复合物。SCF复合体的FBXWs家族参与调控ASK1的泛素化与磷酸化,我们发现FBXW5能够直接泛素化激活ASK1,并在此基础上进一步阐明了FBXW5调控ASK1的机制。方法1.为了探究FBXW5对ASK1及其下游信号通路的调控作用,应用免疫共沉淀(CO-IP)的方法检测FBXW5和ASK1是否能够相互作用;同时用western blot方法检测在过表达和敲除FBXW5后,ASK1及其下游信号通路激活的情况。2.通过免疫沉淀(IP)和western blot检测FBXW5是否可以泛素化修饰ASK1,介导ASK1泛素化修饰的类型,并明确FBXW5泛素化修饰ASK1的作用位点。3.利用FBXW5的截短体来寻找FBXW5调控ASK1泛素化的具体结构域,并由此推测FBXW5与ASK1相互作用的模式。4.在细胞水平过表达FBXW5的N端(S1)与C端(S3)截短体,研究其对FBXW5调控的ASK1泛素化的影响,并通过western blot以及realtime PCR检测肝细胞在脂肪酸刺激后,细胞中脂质累积,炎症反应,纤维化相关指标的变化,并用油红O染色直观的显示脂质累积状况。5.在小鼠体内通过高压尾静脉注射Sleeping Beauty质粒系统过表达FBXW5的N端(S1)与C端(S3)蛋白,通过westernblot以及realtime PCR在动物水平检测FBXW5(S1)和FBXW5(S3)是否具有成为治疗NASH的先导药物的潜力。结果1.FBXW5与ASK1能够相互作用,过表达FBXW5能够激活ASK1及其下游信号通路。2.FBXW5能够促进ASK1的K63类型的泛素化,但ASK1第1037或(和)1046赖氨酸位点突变后,FBXW5则不能促进ASK1泛素化。3.FBXW5的N端和C端均参与调控泛素化ASK1。推测FBXW5的N端参与泛素化链传递,C端则负责与底物ASK1相互作用。4.分别在细胞和动物水平证实FBXW5的N端和C端在被竞争性抑制后,能够缓解肝脏的脂肪变性、纤维化以及降低炎症反应。结论FBXW5与ASK1相互作用并介导ASK1的1037、1046位赖氨酸的K63类型泛素化,从而激活ASK1及其下游信号通路。进一步研究表明FBXW5对ASK1泛素化调控主要依赖于其N端F-box结构域与C端WD40结构域,因此FBXW5 N端(S1)和C端(S3)截短蛋白片段可以竞争性抑制FBXW5的功能,从而减缓NASH症状,提示FBXW5(S1)和FBXW5(S3)蛋白片段可能具有成为治疗NASH的先导药物的潜力。