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背景:缺血性心脏病(ischaemic heart disease,IHD)是糖尿病患者的主要心血管并发症及首要致死病因;临床研究显示,与非糖尿病患者相比,糖尿病患者缺血再灌注(ischaemia reperfusion,IR)心肌的易损性增加,且预后更差,死亡率更高。缺血后处理(ischaemic post-conditioning,IPO)被证实为一种减轻心肌缺血再灌注损伤(ischaemia reperfusion injury,IRI)的有效举措;然而,有研究显示IPO对糖尿病IR心肌的保护作用减弱或消失,其具体机制尚未阐述明确。DJ-1是一种新型癌基因,近年的研究认为它在抗凋亡,抗氧化应激,正性调控自噬等方面扮演了十分重要的角色。自噬作用在维持细胞正常结构和功能方面具有重大的意义,它参与了心肌IRI的病理生理过程,且IPO发挥心肌保护作用的机制之一就是调控IR心肌中的自噬水平。有研究显示,糖尿病心肌中DJ-1蛋白的表达量显著降低,自噬水平明显受抑,这可能是糖尿病心肌不易耐受IRI且对IPO不敏感的重要原因,但具体的分子机制仍然未明。目的:本研究旨在探讨是否由于糖尿病心肌中DJ-1蛋白表达量降低,调控自噬的信号通路失活,致使心肌自噬水平受抑制,进而导致糖尿病心肌对IR的易损性增加且对IPO的保护作用失敏感。方法:1.动物实验:采用成年健康雄性SpragueDawley(SD)大鼠为实验对象,1型糖尿病模型由大鼠腹腔注射链脲霉素(streptozocin,STZ)60mg/kg制备,血糖≥16.7mmol/L为模型制备成功,饲养8周后,将其与同龄非糖尿病大鼠按随机数字表原则分为6组(n=12):①非糖尿病+假手术组(N+S);②非糖尿病+缺血再灌注组(N+IR);③非糖尿病+缺血后处理组(N+IPO);④糖尿病+假手术组(DM+S);⑤糖尿病+缺血再灌注组(DM+IR);⑥糖尿病+缺血后处理组(DM+IPO)。为了验证自噬激动剂雷帕霉素以及腺相关病毒介导的心肌DJ-1过表达在糖尿病心肌IR和IPO中的作用,进一步分为以下5组(n=12):①糖尿病+假手术+雷帕霉素组(DM+S+R);②糖尿病+缺血再灌注+雷帕霉素组(DM+IR+R);③ 糖尿病+缺血后处理+雷帕霉素组(DM+IPO+R);④糖尿病+缺血再灌注+DJ-1过表达组(DM+IPO+AAV9-CMV-DJ-1);⑤糖尿病+缺血后处理+DJ-1过表达组(DM+IR+AAV9-CMV-DJ-1)。假手术组不结扎左冠状动脉前降支(LAD);心肌IR模型采用结扎LAD 30min和开放120min的方法建立;缺血后处理组于再灌注前行3个循环的再灌注l0s/缺血10s。术中监测Ⅱ导联心电图、心率和平均动脉压。术毕,应用Evans Blue和TTC双染色法检测心肌梗死面积;在透射电镜下观察心肌组织中自噬小体数量;用相应试剂盒检测血清肌酸激酶-MB(CK-MB)水平和心肌丙二醛(MDA)水平;Western Blotting检测心肌中DJ-1、一磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、磷酸化AMPK(p-AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、p70核糖体蛋白S6激酶(p70s6k)、p-p70s6k、微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)、泛素结合蛋白p62及自噬效应蛋白Beclin-1的表达量。2.细胞实验:大鼠源H9c2心肌细胞株常规传代培养,按随机数字表原则分为8组:①低糖组(LG,糖浓度5.5mM);②低糖+缺氧复氧组(LG+HR);③低糖+缺氧后处理组(LG+HPO);④高糖组(HG,糖尿病30mM);⑤高糖+缺氧复氧组(HG+HR);⑥高糖+缺氧后处理组(HG+HPO);⑦高糖+缺氧复氧+雷帕霉素组(HG+HR+R);⑧高糖+缺氧后处理+雷帕霉素组(HG+HPO+R)。为了验证DJ-1过表达对高糖H9c2细胞HR及HPO的影响以及AMPK介导的自噬在此过程中发挥的作用,进一步分为以下6组:①高糖+缺氧复氧+DJ-1过表达组(p-EX-2-EGFP-DJ-1)(HG+HR+D);②高糖+缺氧后处理+DJ-1过表达组(HG+HPO+D);③高糖+缺氧复氧+DJ-1基因敲除(HG+HR+DJ-1siRNA);④高糖+缺氧后处理+DJ-1基因敲除(HG+HPO+DJ-1siRNA);⑤高糖+缺氧后处理+DJ-1过表达+自噬抑制剂3-MA组(HG+HR+D+3-MA);⑥高糖+缺氧后处理+DJ-1过表达+AMPK抑制剂复合物C组(HG+HR+D+CC)。对照组细胞置于37℃常氧(10%C02,90%大气)环境下培养;缺氧复氧组细胞置于缺氧(10%CO2,90%N2)环境中培养4h,再置于常氧环境中复氧2h;缺氧后处理组于复氧前行3个循环的复氧5min/缺氧5min。采用CCK-8法检测细胞活性,取细胞上清检测乳酸脱氢酶(LDH)含量,试剂盒检测细胞MDA含量,单丹磺酰尸胺(MDC)染色检测细胞自噬空泡数量,JC-1探针染色检测细胞线粒体膜电位,流式细胞术检测细胞的凋亡率;Western Blotting检测心肌细胞中DJ-1、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt、p70s6k、p-p70s6k、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62 及 Beclin-1 的表达量。结果1.动物实验:(1)与非糖尿病大鼠相比,糖尿病大鼠心肌自噬水平下降(自噬小体数量、LC3Ⅱ/Ⅰ比值及Beclin-1量降低,p62量增加),AMPK/mTOR通路活性降低(p-AMPK和p-Akt表达水平降低、p-mTOR和p-70s6k水平增高),DJ-1表达量减少。(2)心肌IR后,与非糖尿病大鼠相比,糖尿病大鼠心肌梗死面积、血清CK-MB和心肌MDA含量显著增加,心肌自噬水平、AMPK/mTOR通路活性及DJ-1表达量显著降低。IPO能显著减少非糖尿病大鼠的心梗面积、血清CK-MB水平和心肌MDA含量,同时增强心肌自噬,激活AMPK/mTOR通路活性,上调DJ-1表达量;而上述现象不发生在糖尿病心肌中。(3)自噬激动剂雷帕霉素能有效恢复糖尿病大鼠心肌对IPO的敏感性,表现为心梗面积减小,血清CK-MB水平和心肌MDA含量降低,心功能改善,同时伴随心肌自噬水平增加,但DJ-1和AMPK/mTOR通路活性未见显著变化。(4)AAV9介导的心肌DJ-1过表达显著恢复IPO对糖尿病大鼠IR心肌的保护作用,表现为心梗面积减小,心功能改善,血清CK-MB水平和心肌MDA含量降低,同时伴随心肌AMPK/mTOR信号通路激活,自噬活动增强。2.细胞实验:(1)与低糖组相比,高糖组H9c2细胞自噬水平、AMPK/mTOR信号通路活性降低,而DJ-1蛋白表达量增高;H/R处理后,与低糖组比较,高糖组H9c2细胞存活率降低,LDH活性和MDA含量增加,同时DJ-1含量、AMPK/mTOR通路活性及细胞自噬水平均显著降低。HPO能有效减轻低糖组细胞的H/R损伤程度(细胞存活率增加,LDH和MDA含量降低),同时上调DJ-1含量、AMPK/mTOR通路活性及细胞自噬水平;然而,上述现象不发生在高糖H9c2细胞中。(2)自噬激动剂雷帕霉素能有效恢复HPO对高糖H9c2细胞的保护作用,表现为细胞存活率增加,LDH活性和MDA含量下降,伴随着细胞自噬水平的增加,但对DJ-1含量和AMPK/mTOR通路的活性物明显影响。(3)DJ-1过表达,而非DJ-1沉默,有效恢复了 HPO对高糖H9c2细胞的保护作用,表现为细胞活性增加,LDH活性和MDA含量降低,线粒体膜电位降低及细胞凋亡减少,同时伴随着AMPK/mTOR信号通路的激活和细胞自噬水平的增加;自噬抑制剂3-MA及AMPK抑制剂复合物C能完全阻断上述保护作用。结论:1.动物实验:(1)糖尿病心肌中DJ-1表达下调,自噬活动受抑制,可能是其对IR易损性增加且对IPO失敏感的重要机制之一;(2)增强糖尿病心肌的自噬水平,能有效恢复其对IPO对敏感性;(3)过表达DJ-1,可能通过激活AMPK/mTOR信号通路调控的自噬作用,恢复IPO对糖尿病IR心肌的保护作用。2.细胞实验:(1)自噬水平的下调可能是高糖H9c2细胞对HPO保护作用不敏感的重要原因。激活自噬能有效恢复HPO对高糖培养H9c2细胞的保护作用。(2)DJ-1过表达可通过激活AMPK/mTOR信号通路及其下游的自噬,从而恢复高糖H9c2细胞对HPO保护作用的敏感性。