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本项目组前期研究发现，肾移植受者发生抗体介导排斥反应时移植肾组织肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells,RTECs）异常高表达B细胞活化因子（B cell activating factor belong to the tumor necrosis factor family,BAFF）及其受体（BAFF receptor,BAFF-R）。系列研究结果提示BAFF/BAFF-R信号增强可能经RTECs参与肾移植抗体介导的慢性排斥反应过程。为进一步了解BAFF/BAFF-R在 RTECs的表达及其意义，开展了本项研究。研究中以小鼠原代 RTECs为研究对象，分析了 BAFF信号对RTECs生长特性的影响及可能机制。 第一部分 目的：旨在建立获得纯度较高的小鼠原代RTECs分离、培养方法，为后续研究奠定基础。 方法：选用4～10周龄的C57BL/6小鼠，取其肾皮质，以酶消化法结合筛网过滤法分离RTECs。选择含10%胎牛血清、1%双抗、1%胰岛素-转铁蛋白-硒-X和50nmol/L氢化可的松的DMEM/F12完全培养基用以细胞培养；细胞免疫荧光法检测上皮细胞特异性表达的细胞角蛋白18（cytokeratin-18,CK-18）及荧光素钠转运功能对RTECs进行鉴定。 结果：融合成单层的RTECs衔接紧密，呈现出多边形鹅卵石样的典型形态，折光性好；免疫荧光检测结果显示细胞呈现黄绿色荧光，且阳性率在90%以上；荧光素钠转运实验结果显示随着时间延长胞内荧光强度逐渐增强，提示该细胞具有RTECs的离子转运功能。 结论：本实验建立了简单、快速、重复性强且纯度较高的小鼠原代RTECs培养方法。 第二部分 目的：研究BAFF及其受体BAFF-R在小鼠原代RTECs的表达及BAFF/BAFF-R信号对RTECs生长特性的影响。 方法：以500U/mL干扰素（interferon,IFN）-γ刺激小鼠原代RTECs，48h后流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测RTECs细胞膜上BAFF及BAFF受体（BAFF-R）的表达；以重组BAFF蛋白和/或阻断性B细胞活化因子受体-Fc融合蛋白（BAFF-R-Fc）刺激RTECs，48h后以荧光素钠转运实验检测RTECs离子转运功能、细胞免疫荧光法检测CK-18的表达、四唑氮化合物（MTS）法检测RTECs增殖情况、FCM法检测细胞凋亡情况。采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析，P<0.05被认为差异具有统计意义。 结果：小鼠RTECs经IFN-γ作用后，BAFF-R表达水平较未受IFN-γ刺激组显著上调（4166.250±913.914vs3602.750±875.584，P<0.05）。荧光素钠转运实验结果显示，BAFF刺激组的平均光密度为（0.011±0.003），显著低于BAFF-R-Fc+BAFF组（0.020±0.007）和对照组（0.016±0.006），差异均具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光结果显示，BAFF刺激组平均光密度为（0.032±0.005），显著低于BAFF-R-Fc+BAFF组（0.043±0.007）和对照组（0.041±0.008），差异均具有统计学意义（P<0.05）。5ng/mL、20ng/mL BAFF刺激组细胞增殖OD值分别为（1.532±0.058）、（1.509±0.056）显著高于对照组（1.473±0.045），差异均具有统计学意义（P<0.05）；且5ng/mL BAFF刺激组显著高于BAFF-R-Fc+BAFF组（1.477±0.050），差异具有统计学意义（P<0.05）。BAFF刺激组细胞凋亡率为（39.850%±8.544%），显著低于BAFF-R-Fc+BAFF组（42.950%±8.330%）和对照组（44.467%±7.642%），差异均具有统计学意义（P<0.05）。 结论：BAFF/BAFF-R信号增强能促进RTECs增殖、抑制RTECs凋亡，但使其上皮细胞特性和离子转运功能显著下降。 第三部分 目的：研究BAFF信号增强对RTECs间质样转变的影响及可能机制。 方法：以重组BAFF蛋白和/或阻断性BAFF-R-Fc刺激小鼠RTECs，48h后提取细胞全蛋白，Western blot法检测上皮标志蛋白E-钙粘蛋白（E-cadherin）、间质标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、β-链蛋白（β-catenin）及肽脯氨酰基顺反异构酶1（Pin1）的表达；Pin1siRNA瞬时转染小鼠RTECs，48h后RT-PCR检测Pin1mRNA的表达，72h后Western blot法检测Pin1蛋白的表达；以重组BAFF蛋白和/或阻断性BAFF-R-Fc刺激经Pin1siRNA或对照siRNA转染的RTECs，48h后提取细胞全蛋白，Western blot法检测α-SMA、E-Cadherin蛋白在各组RTECs的表达；以ImageJ分析软件对蛋白条带进行分析。采用SPSS17.0对数据进行统计分析，P<0.05被认为具有统计意义。 结果：Western blot结果显示，重组BAFF蛋白刺激组小鼠RTECs下调表达E-Cadherin，而上调表达α-SMA及Pin1蛋白，较空白对照组及BAFF-R-Fc+BAFF先后刺激组，差异均具有统计学意义（P<0.05）；β-catenin蛋白的表达变化不显著，与空白对照组及BAFF-R-Fc+BAFF先后刺激组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。普通PCR及Western blot结果显示，与对照siRNA组及空白对照组比较，小鼠RTECs经Pin1 siRNA瞬时转染后，Pin1 mRNA表达量减少约80%，Pin1蛋白表达量明显减少。小鼠RTECs经Pin1 siRNA转染后，再经重组BAFF蛋白刺激48h，E-Cadherin蛋白的表达较对照siRNA+ BAFF蛋白刺激组显著上调，差异具有统计学意义（P<0.05），而α-SMA蛋白的表达较对照siRNA+ BAFF蛋白刺激组显著下调，差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论：BAFF信号经上调Pin1蛋白表达促进RTECs向间质样细胞转变。