酿酒酵母Ssz1蛋白新功能的研究

来源 :江苏大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:TRACY101688
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目的:过表达SSZ1能够抑制酵母(scj1-1Δire1)的温度敏感生长表型和恢复酵母(Δscj1Δire1)的生长致死效应。说明在过表达的情况下,SSZ1可能行使了不同于以往报道的细胞功能。利用过表达SSZ1给酵母带来的基因表达谱变化,预测过表达SSZ1行使的细胞功能,并通过实验进一步确证。另外,还探究了SSZ1结构域变化对其行使细胞新功能的影响。本项研究可加深对SCJ1基因功能和UPR机制的理解。  方法:使用Primer premier5.0软件设计SSZ1结构域缺失突变体引物,选取带TDH3强启动子的穿梭载体,经PCR扩增,纯化,酶切和连接,构建SSZ1结构域缺失突变体载体,并测序鉴定;将构建的载体分别转入野生型(W303)和温度敏感型(scj1-1Δire1)酵母,利用连续稀释培养法检测过表达SSZ1突变体基因对野生型酵母抗药性的影响和对温度敏感型酵母温度敏感效应的影响;将构建的载体转入颜色分离酵母,利用划线培养法观察酵母生长的颜色,验证过表达SSZ1突变体基因是否具有完整的SSZ1细胞新功能。利用在线软件SWISS-MODEL预测SSZ1结构域缺失突变体的蛋白结构,分析可能存在的细胞新功能的核心结构域。应用DNA microarray技术,获得过表达SSZ1给酵母带来的基因表达谱变化,通过差异表达基因的聚类分析,GO富集分析和PPI网络分析,预测SSZ1基因可能的细胞功能,并通过生化实验验证其细胞功能。采用基因克隆,对筛选到的差异基因进行载体构建,通过连续稀释培养法验证差异表达基因的细胞功能。最后,我们还对差异表达基因中涉及PDR通路,UPR通路,CWI通路的相关基因表达量进行了分析,从表达水平上确认过表达SSZ1与这三种通路的关系。  结果:(1)成功构建7个SSZ1缺失突变表达载体;(2)SSZ1突变体SSZ1Δ2-40,Δ2-115,Δ2-200,Δ2-240,Δ2-303,Δ2-372,Δ2-402转入野生型酵母中,不具有抗药性;(3)SSZ1突变体SSZ1Δ2-200,Δ2-240,Δ2-372,Δ2-402有抑制温度敏感型酵母生长表型的功能,相反的,SSZ1突变体SSZ1Δ2-40,Δ2-115,Δ2-303,不具有抑制功能;(4)颜色分离酵母实验显示,SSZ1Δ2-200,Δ2-240,Δ2-372,Δ2-402有红白相间的菌落出现,表明它们可能具有与完整SSZ1相同的细胞新功能。SSZ1Δ2-40,Δ2-115,Δ2-303则没有红白相间的菌落出现;(5)转录表达谱分析结果显示过表达SSZ1能诱导升高多向耐药性通路(PDR)的相关基因,不诱导升高未折叠蛋白反应(UPR)的靶基因,过表达SSZ1还能够上调细胞壁完整性信号通路(CWI)相关基因和转录因子RSC30的表达;(6)完成多个差异表达基因的克隆并验证其细胞功能。PDR1,PDR5,RHO1,SMP1,KDX1不具有抑制酵母(scj1-1Δire1)温度敏感表型的功能。1M渗透压稳定剂山梨醇能够抑制(scj1-1Δire1)酵母温度敏感表型而且RSC30有抑制酵母(scj1-1Δire1)温度敏感表型的功能。  结论:过表达SSZ1具有维持酵母细胞稳健性(Cellular robustness)的新功能。Ssz1p结构域与其新功能有密切关系,Ssz1p的403-538位氨基酸是其新功能所必需的,另外,存在2个促进和2个抑制新功能发挥作用的结构域,它们分别是:2-40,241-303和116-200,304-372;SSZ1新功能不通过PDR通路和UPR通路,而是通过提高细胞壁的完整性,但是结果显示过表达SSZ1的新功能不依赖CWI通路;最后,我们发现过表达RSC30也能抑制酵母(scj1-1Δire1)的温度敏感生长表型,表明Ssz1蛋白新功能可能与RSC30功能有关。
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