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本研究结合水稻耐热遗传育种中遇到的问题,在基因高通重筛选方法和生物信息技术等前期研究的基础上,对一个编码CCCH型水稻锌指蛋白的基因OsZF2进行研究,以基因功能鉴定与转基因育种技术优化为最终目标,主要结果如下:
1.揭示OsZF2受高温诱导的表达变化趋势
通过各种高温胁迫处理表明,在常温(25℃)下OsZF2基因表达水平基本一致;而高温(40℃)时OsZF2基因短时间内表达明显加强,随时间的推移基因表达量呈现波浪状变化趋势,其特异性主要表现在:一是基因受热诱导后表达量出现升-降-升变化;二是基因表达量在变更的昼夜中重复起伏变化;三是高温结合强光照可促进基因表达。推测该基因的表达受到温度、光照和水稻内生节律影响。
2.构建过量表达载体OsZF2-pCAMBIA1380
从水稻中扩增OsZF2基因,回收目的片段再将其插入含组成型启动子Ubi的双元载体pCAMBIA1380中,将重组子OsZF2-pCAMBIA1380用HindIII和SpeI双酶切鉴定和测序,结果表明基因没有发生突变。将表达质粒转入农杆菌EHA 105并证明其具有遗传稳定性。
3.探索农杆菌介导的籼稻花药培养转化方法
以籼稻恢复系航恢七号作主要研究材料,将培养基成份进行搭配和改良,并对外源脯氨酸的浓度、诱导的光温条件进行比较表明,综合改善培养条件可提高籼稻花药愈伤组织诱导的数量和质量。同时,从中筛选出适合航恢七号花药培养的最佳诱导方法:采用32℃,20001ux的光温条件,用改良的NMB作基本培养基,添加脯氨酸的浓度控制在1000-2000mg/L,其平均出愈率可达到27.65%,无需继代即可作转化受体。另外,研究表明,继代培养次数在3次以下可减轻籼稻花药愈伤褐化现象;适当降低农杆菌侵染浓度不仅可以降低污染率还可以获得较多的抗性愈伤。当航恢七号的潮霉素筛选浓度为40mg/L,农杆菌菌液OD600=0.15时,污染率在1%以内而抗性愈伤率可达到62.2%。
4.获得OsZF2的阳性转化植株
用中花11的成熟胚作外植体,获得31个转基因株系,其To代阳性转化植株的花粉育性和农艺性状普遍正常。此外,观察到分蘖、株型、抽穗结实等方面有特殊表现的阳性转化植株,如编号为20、24、17和15-4等材料。
研究意义在于揭示OsZF2基因的表达特异性,探索基因转化的合适路径,为OsZF2的基因功能鉴定和水稻耐热材料的创制奠定基础。