在体外条件下,猪小肠微生物均能大量代谢必需氨基酸。然而在体内条件下,肠道微生物对日粮氨基酸代谢的影响还不清楚。抗生素作为促生长剂被广泛应用于动物生产中,其可能的机制在于能调控肠道微生物的组成而减少微生物对营养物质的利用,如氨基酸。在不同生长阶段,抗生素的使用对小肠微生物菌群以及氨基酸代谢的影响是否存在不同,目前还不清楚。早期环境的改变对宿主代谢以及微生物组成具有长期影响,而目前关于早期阶段使用抗生素后对后期生长猪小肠微生物菌群组成以及氨基酸代谢是否具有长期影响还不得而知。此外,回肠末端灌注抗生素干预后肠微生物后,对前肠微生物组成以及氨基酸吸收是否具有反馈调节还不清楚。本研究以猪为研究对象,采用连续饲养试验以及回肠末端灌注试验,从不同的角度研究抗生素对小肠微生物菌群结构以及氨基酸代谢的影响。1.抗生素干预对哺乳仔猪小肠微生物菌群和氨基酸代谢的影响试验选取16窝7日龄的哺乳仔猪,随机分为两组,每组8个重复。仔猪在吃母乳的同时分别饲喂不含有和含有抗生素(各50 mg/kg日粮的土霉素钙、吉他霉素和喹乙醇)的教槽料,试验期为16天。结果显示,与对照组相比,抗生素对生长性能无显著影响(P>0.05),但显著增加胰腺指数(P<0.05)。抗生素处理显著增加了血清中尿素和血氨的浓度(P<0.05),但降低了血糖的浓度(P<0.05)。定量结果表明,抗生素处理显著降低空肠总菌、厚壁菌门和Lactobacillus的数量(P<0.05),但显著增加回肠食糜中Escherichia coli的数量(P<0.05)。高通量分析结果表明,抗生素改变了回肠的菌群结构。在属水平上,抗生素显著增加了回肠Streptococcus、Rothia、Actinomyces、Corynebacterium等细菌的丰度(P<0.05),显著降低了Lactobacillus丰度(P<0.05)。氨基酸分析结果显示,抗生素处理显著降低了空肠和回肠食糜中游离氨基酸的浓度(P<0.05),但显著增加了血清、空肠和回肠组织中氨基酸的浓度(P<0.05)。抗生素处理显著上调了空肠黏膜中氨基酸转运载体y+LATl和b0,+AT、小肽转运载体PepT1和Na+/K+-ATPase(ATP1A1),以及回肠黏膜EAAC1、ASCT2、ATB0,+和y+LA1的mRNA表达量(P<0.05),同时上调空肠和回肠黏膜氨基酸感受体T1R3的mRNA表达量(P<0.05)。以上结果表明,抗生素减少肠道中细菌的数量并改变回肠微生物的组成,降低空肠和回肠食糜中部分氨基酸的浓度,而增加血清中部分氨基酸的浓度,上调空肠和回肠部分氨基酸转运载体基因的表达。2.抗生素干预对断奶仔猪小肠微生物菌群和氨基酸代谢的影响本试验在第二章动物试验的基础上,仔猪在23日龄断奶后继续饲喂相同的含有和不含有抗生素的基础日粮,试验18天后,进行屠宰。结果显示,与对照组相比,抗生素对断奶仔猪的平均日增重和平均日采食量无显著影响(P>0.05),但显著提高饲料转化率、肾脏指数以及血清中尿素氮的浓度(P<0.05)。微生物定量结果表明,抗生素处理显著降低了回肠食糜中总菌和厚壁菌门的数量(P<0.05),同时有降低空肠食糜中总菌数量的趋势(P=0.069)。高通量数据结果显示,抗生素显著降低了回肠中厚壁菌门的相对丰度,而显著增加了变形菌门和拟杆菌门的相对丰度(P<0.05)。在属水平上,抗生素显著增加回肠食糜中了 Escherichia-Shigella和Actinomyces的相对丰度(P<0.05)。在种水平上,抗生素显著降低了Lactobacillus mucosae和Bac illus methylotrophicus 的相对丰度(P<0.05),但显著增加 了 Escherichia coli、Actinobacillus minor和Streptococcusgallolyticus的相对丰度(P<0.05)。氨基酸分析结果显示,与对照组相比,抗生素处理显著降低空肠和回肠食糜中游离氨基酸的浓度(P<0.05),显著增加了血液、空肠和回肠组织中氨基酸的浓度(P<0.05)。在空肠,抗生素处理显著上调了氨基酸转运载体CA T1、EAAC1、ASCT2、y+LAT1、b0,+AT和Na+/K+-ATPase(ATP1A)的mRNA表达量(P<0.05),同时上调了小肽转运载体PepT1的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)。在回肠,抗生素处理显著上调ASCT2、y+LATl、b0,+AT、B0A T1和ATP1A1的mRNA表达量(P<0.05)。同时,抗生素处理显著上调空肠氨基酸感受体基因T1R3和CaSR以及回肠T1R3的mRNA表达量(P<0.05)。以上结果表明,抗生素处理显著提高断奶仔猪的饲料转化率,减少小肠中细菌的数量,并改变回肠微生物菌群的结构,上调氨基酸转运载体基因的表达,使得更多的日粮氨基酸被吸收进入血液。3.早期抗生素干预对后期生长猪小肠微生物菌群和氨基酸代谢的影响本试验在第三章的基础上,停止饲喂抗生素后,对照组和抗生素组猪在42～77和77～120日龄两个阶段饲喂相同且不含有任何抗生素的基础日粮。在77日龄和120日龄分别进行屠宰采样。结果显示,在77日龄,与对照组相比,早期抗生素干预显著降低了空肠食糜中拟杆菌门的数量(P<0.05),降低了回肠食糜中微生物的多样性和丰度(P<0.05),降低 Clostridium sensu stricto 1、Blautia、Butyrivibrio的相对丰度(P<0.05),但增加Streptococcus的相对丰度(P<0.05)。氨基酸分析结果显示,早期抗生素干预增加了血清、空肠和回肠组织中部分氨基酸的浓度(P<0.05),但对空肠和回肠食糜中氨基酸的浓度无显著影响(P>0.05);上调空肠黏膜EAAC1、b0,+AT和B0AT1的mRNA表达量(P<0.05),对回肠氨基酸转运体基因、空肠和回肠黏膜氨基酸感受体基因的表达无显著影响(P<0.05)。在120日龄;早期抗生素干预显著降低空肠食糜中总菌和拟杆菌门的数量(P<0.05);显著增加了回肠Bifidobacterium、Blautia、unclassified Ruminococcaceae 和Mogibacterium等的相对丰度(P<0.05),显著降低了Streptococcus和Escherichia-Shigella的丰度(P<0.05)。氨基酸分析结果显示,早期抗生素处理显著增加血清、空肠和回肠组织以及食糜中部分氨基酸的浓度(P<0.05);上调空肠黏膜CAT1、ASCT2、ATB0,+、B0AT1、ATP1A1,以及回肠 CAT1、ASCT2、B0AT1、Na+/K+-ATPase(ATP1A1)的 mRNA 表达量(P<0.05),但降低空肠PepT1的mRNA表达量(P<0.05),同时上调空肠T1R3和CaSR的mRNA表达量(P<0.05);以上结果表明,早期抗生素处理对后期不同生长阶段猪的小肠微生物和氨基酸代谢具有长期的影响,并且存在日龄差异。4体外发酵法研究经抗生素干预后的猪回肠微生物对氨基酸代谢的影响试验选取回肠末端灌注和未灌注抗生素的仔猪回肠食糜为接种物,将其接种到只含有10 mmol/L单一氨基酸的厌氧培养基中,体外培养24 h。分别采取体外培养试验的Oh和24h的样品用于测定游离氨基酸、氨氮、MCP和生物胺的浓度。结果显示,与对照组相比,接种抗生素干预后的食糜显著降低了微生物对赖氨酸、苏氨酸和精氨酸的利用(P<0.05)。同时显著降低了以赖氨酸、苏氨酸、精氨酸和缬氨酸为底物时的氨氮浓度(P<0.05),显著降低了以赖氨酸为底物时培养基中腐胺、P胺以及精胺的浓度(P<0.05),并降低了以精氨酸为底物时培养基中腐胺的浓度(P<0.05),但对MCP的含量无显著影响(P>0.05)。DGGE和定量分析结果表明,灌注抗生素显著降低回肠食糜中微生物的多样性(P<0.05),改变了其组成,但对菌群数量无显著影响。接种抗生素干预后的回肠食糜,显著降低以赖氨酸、苏氨酸和精氨酸为底物的发酵液中微生物的多样性(P<0.05),显著降低了以赖氨酸和苏氨酸为底物的培养基中Lactobacillus的数量(P<0.05),并降低了以苏氨酸和精氨酸为底物的培养基中Escherichia coli的数量(P<0.05),并有降低以赖氨酸为底物的培养基中Escherichia coli的趋势(P=0.057)。以上结果表明,回肠末端灌注抗生素显著改变了回肠食糜中微生物区系,体外条件下接种抗生素干预后的回肠微生物对不同类型氨基酸的代谢能力不同,降低了对赖氨酸、苏氨酸和精氨酸的利用,但对谷氨酸和支链氨基酸的代谢无影响。5回肠末端灌注抗生素对仔猪氨基酸组成、小肠氨基酸转运体和感受体基因表达的影响本章在第五章动物试验的基础上,于试验第26天,进行屠宰采样。试验结果表明,回肠灌注抗生素对空肠和回肠食糜主要微生物的数量无显著影响(P>0.05)。与对照组相比,回肠灌注抗生素显著降低血清和空肠组织中氨基酸的浓度,增加了空肠和回肠食糜中氨基酸的浓度。回肠灌注抗生素显著降低了空肠黏膜中氨基酸转运载体EAAC1、C4T1、B0,+AT、ASCT2和ATB0,+的 mRNA 表达量(P<0.05),显著降低了回肠黏膜ASCT2的表达量,有增加空肠小肽转运载体PepT1表达量的趋势(P=0.064)。同时,回肠灌注抗生素显著增加了回肠氨基酸感受体基因CaSR的表达量(P<0.05),并有增加T1R3表达量的趋势(P=0.054),但对空肠黏膜氨基酸感受体基因的表达无显著影响。以上结果表明,回肠灌注抗生素通过下调氨基酸和小肽转运载体的表达,降低了血清和空肠组织中氨基酸的浓度,增加了空肠和回肠食糜中氨基酸的浓度,但对微生物数量无影响。综上所述,通过连续饲养试验,本研究发现抗生素减少了小肠微生物的数量,并改变其微生物的组成,上调氨基酸转运体基因的表达,使得更多的氨基酸被吸收进入血液,并且抗生素对小肠微生物和氨基酸代谢具有长期的影响。体外发酵结果显示,接种抗生素干预后的回肠食糜降低微生物对赖氨酸、苏氨酸和精氨酸的利用。回肠灌注抗生素抑制前肠氨基酸转运载体基因的表达,降低空肠对氨基酸的吸收。