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生物催化的高效性、选择性、安全性以及环境友好等优点,使其在一些化学合成领域,特别是在对映体纯的手性化合物的合成和消旋体拆分等方面,具有化学催化不可比拟的优势。生物催化的还原反应能使分子内的羰基或碳-碳双键立体选择性的还原,将潜手性底物转化为手性产物,在不对称合成中有着重要的作用。 本文通过二步发酵法,采用TLC分析方法,考察了11株供试真菌对左旋一叶萩碱的转化能力,发现分离株Aspergillus sp.D-1能够完全转化左旋一叶萩碱,产生一种转化产物。经制备规模转化、硅胶柱层析分离和UV、IR、MS、1H,13C-NMR等光谱学鉴定,确定转化产物为14,15-二氢一叶萩碱。从而证明了Aspergillus sp.D-1能够催化左旋一叶萩碱的不饱和内酯共轭体系中γ,δ-碳碳双键的还原反应。 利用传统形态学和分子生物学等分类方法对Aspergillus sp.D-1进行分类鉴定。根据其形态学特征,将Aspergillus sp.D-1归属在曲霉属巢状亚属杂色组。采用真菌核糖体基因内转录间隔区(ITS)序列作为分子标记,利用DNAMAN 5.2.2和Mega 3.0等软件对其进行同源性和进化关系分析,在种的水平上将Aspergillus sp.D-1归属为Aspergillus versicolor,并将该菌株命名为A.versicolor D-1。首次发现A.versicolor具有还原不饱和内酯共轭体系中γ,δ-碳碳双键的能力。 通过单因素实验,采用二步发酵法和HPLC分析方法,考察了初始pH、温度和底物浓度对A.versicolor D-1静息细胞还原左旋一叶萩碱的影响。结果表明,Aspergillus versicolor D-1静息细胞在初始pH值为7.0、温度为28℃、底物浓度为146.7 mg/L的条件下反应8 h,A.versicolor D-1静息细胞的活性最大,单位重量的菌丝体的最大转化量为486.7 mg/L/g(干细胞),转化率在98%以上。通过继续延长转化时间,检测发酵液中14,15-二氢一叶萩碱的浓度恒定,从而证明了A.versicolor D-1转化左旋一叶萩碱具有选择性。首次在真菌中发现这种选择性催化异型生物质不饱和内酯共轭体系中γ,δ-碳碳双键的还原反应。 采用HPLC分析方法,通过跟踪检测左旋一叶萩碱还原酶的活性,发现左旋一叶萩碱还原酶是一种存在于胞浆中的可溶性蛋白。考察左旋一叶萩碱在转化体系中存在与否对A.versicolor D-1产生左旋一叶萩碱还原酶的影响,发现左旋一叶萩碱还原酶是诱导酶,左旋一叶萩碱既是底物,又是诱导物。通过检测不同辅因子存在的条件下左旋一叶