前言:　　 结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内其发病率每年以2%的速度增长。随着诊疗技术的不断进步,结直肠癌患者的预后有了一定改善,但病死率仍居高不下。导致结直肠癌患者死亡的主要原因是复发和转移,而细胞间粘附的缺失在肿瘤侵袭和转移的过程中发挥着至关重要的作用。　　 E-钙粘蛋白(E-cadherin,E-cad)是一种钙依赖性的细胞间粘附分子,在粘附连接的形成和维持其稳定上发挥着至关重要的作用。E-cadherin通过与多种连环蛋白(catenin,Cat)结合形成钙粘蛋白.连环蛋白复合体(cadherin catenin complex,CCC),维持细胞间粘附连接稳定。　　 P120连环蛋白(P120-catenin,P120ctn)与α-、β-、γ-catenin的结构相似,但在与钙粘蛋白结合位点和功能方面存在差异。P120ctn最初被证实为Src癌蛋白的主要作用底物,目前P120ctn已作为一种E-cadherin相关蛋白被广泛接受,它参与调节E钙粘蛋白的稳定和细胞间的粘附,并与Kaiso形成复合物调控基因的表达。　　 δ-连环蛋白(δ-catenin,5-cat)拥有10个犰狳(Armadillo,Arm)重复结构,属于连环蛋白家族的成员之一。最初认为δ-catenin仅表达于大脑神经元,但最近的一些研究发现δ-catenin与癌症也存在着密切的关联。Burger等报道与良性前列腺增生相比,前列腺癌中δ-catenin的转录明显上调,其蛋白表达也显著增加。Zhang等又报道了δ-catenin在肺癌组织中过表达并促进非小细胞肺癌的恶性表型。这些研究表明δ-caterfin与肿瘤的发生发展密切相关。然而在结直肠癌组织中δ-catenin的表达情况如何、δ-catenin的表达与结直肠癌临床病理因素之间存在怎样的关系目前尚不清楚。δ-catenin和P120ctn与E-cadherin分子中JMD(juxtamembrahedomain,近膜域)位点的结合是否存在竞争性以及δ-catenin与结直肠癌增殖和侵袭之间是否存在关联也还尚需证明。　　 本研究中,我们检测了110例CRC样本中δ-catenin,P120cm和E-cadherin的表达情况并探讨了它们的表达与临床病理因素的关系。同时在结肠癌细胞系中分别过表达或干扰δ-catenin和P120ctn,借助免疫共沉淀的方法探讨了两者是否存在与E-cadherin的竞争性结合以及通过MTT及基质胶侵袭实验检测过表达δ-catenin对结肠癌细胞增殖和侵袭能力的影响。　　 材料与方法:　　 一、标本与患者资料　　 110例结直肠癌标本及15例正常结直肠组织(外伤等非肿瘤原因肠切除标本)标本,收集自中国医科大学附属盛京医院病理科存档蜡块。其中有详实术后随访资料的70例为2004年4月-2005年7月手术切除的标本。所有病例均为首发肿瘤,术前未接受放疗和化疗。男性67例,女性43例,年龄31-87岁(中位年龄61岁)。以InternationalUnionAgainstCancer(UICC)TNM病理分期第六版为标准:Ⅰ期14例,Ⅱ期39例,Ⅲ期42例,Ⅳ期15例。纳入病例均为腺癌:其中高分化36例,中分化55例,低分化19例。另外收集30例新鲜结直肠癌及癌旁正常肠粘膜组织(距癌灶边缘5cm以上的最远端切缘)用于提取蛋白质,标本取出后立即放入-80℃冰箱保存备用。　　 二、免疫组织化学染色　　 采用Slxeptavidin-Peroxidase(SP)免疫组织化学方法染色,检测δ-catenin、P120ctn和E-cadherin在110例结直肠癌标本中的表达及其与临床病理因素之间的关系,并分析其中40例原发灶与转移灶配对的标本中δ-catenin表达的差异以及另外70例随访标本中δ-catenin的表达与患者预后的关系。　　 三、细胞培养,质粒转染和RNA干扰　　 人结直肠腺癌细胞系caco-2,SW620和SW48分别培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12或DMEM高糖培养液中。将δ-catenin质粒导入δ-catenin表达较低的caco-2细胞;选择干扰效果较好的δ-cateninsiRNA序列导入δ-catenin表达较高的SW620细胞系。　　 将P120ctn1A和3A质粒导入P120ctn表达缺失的SW48细胞系;选择干扰效果较好的P120cmsiRNA序列导入P120ctn表达较高的caco-2细胞系。　　 四、WesternBlot　　 将含50μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后,转印至PVDF膜,单克隆抗体δ-catenin或E-cadherin4℃孵育过夜,辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2小时后ECL显色。　　 五、免疫共沉淀　　 收集细胞,充分裂解提取蛋白。向300μg蛋白裂解产物中加入3μg诱饵蛋白的抗体,4℃孵育过夜后;加入40μlProteinA+Gagarose继续4℃孵育3小时。充分洗涤后去除上清,加入30μl的SDS上样缓冲液水浴变性。将获得的免疫共沉淀产物,随后进行WesternBlot检测。　　 六、细胞增殖和侵袭能力的测定　　 为观察δ-catenin对结肠癌细胞生物学行为的影响,分别过表达与敲除δ-catenin后,利用MTT、基质胶侵袭实验来检测细胞增殖和侵袭能力的变化。　　 结果:　　 一、δ-catenin在结直肠癌组织中高表达并与患者不良预后相关　　 δ-catenin在正常肠粘膜的胞浆中不表达或呈现较弱的信号,根据评分标准判定为阴性表达。110例结直肠癌组织中δ-catenin呈阳性表达的75例,占68.18%,明显高于正常结直肠组织的表达水平(P＜0.001)。δ-catenin的阳性表达与结直肠癌患者的细胞分化程度、TNM分期和淋巴结转移密切相关(P＜0.05)。　　 P120ctn和E-cadherin在正常结直肠组织细胞中呈膜阳性表达。在结直肠癌组织中P120ctn和E-cadherin膜表达缺失或呈现异位的胞浆表达。P120ctn的异常表达在TNM高分期和有淋巴结转移的患者中显著增加(P＜0.05)。　　 70例有完整随访资料的结直肠癌患者5年生存率为64.29%(45/70),其中δ-cateruin阳性表达的患者5年生存率为51.11%(23/45),明显低于阴性表达者88.00%(22,25)。Cox模型多因素分析结果显示TNM分期(P=0.02)和δ-catenin阳性表达(P=0.033)是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素。　　 二、在结肠癌中δ-catenin和P120ctn与E-cadllerin的结合存在竞争性　　 过表达或干扰δ-catenin后,其与E-cadherin的结合量发生了相应的增加或减少,而P120ctn与E-cadherin的结合显著减少或增加;同理,过表达或干扰P120ctn后,其与E-cadherin的结合量发生了相应的增加或减少,而δ-catenin与E-cadherin的结合发生相反的改变。这提示我们δ-catenjn和P120cm与E-cadherin的结合存在竞争性。　　 三、过表达δ-catenin促进结肠癌细胞的增殖与侵袭　　 MTT显示过表达δ-catenin的结肠癌细胞的增殖能力明显增强(P均＜0.05),而干扰内源性δ-catenin组瘤细胞的增殖能力显著降低(P均＜0.05)。基质胶侵袭结果显示过表达δ-catenin后平均侵袭的细胞数明显增多(P＜0.01);而干扰δ-catenin后,侵袭的细胞数显著减少(P＜0.01)。　　 结论:　　 1、δ-catenin在结直肠癌组织中高表达,且与细胞分化程度、TNM分期、淋巴结转移和患者的不良预后正相关,δ-catenin阳性表达可以作为影响结直肠癌患者预后的独立性危险因素。　　 2、在结肠癌中δ-catenin和P120ctn与E-cadherin竞争性结合。　　 3、过表达δ-catenin促进结肠癌细胞的增殖与侵袭。