研究背景:前B细胞型急性淋巴细胞白血病(Precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia,pre-B-ALL)是儿童常见的恶性疾病,虽然目前长期无病生存率大幅提高,但仍有20%-30%的患儿最终死亡,究其原因在于化疗过程中的不缓解以及复发。近年来,对于pre-B-ALL发生和发展的核酸、蛋白水平的调控机制研究已有大量文献报道,但是在糖基化异常方面报道较少,尤其是关于O-GlcNAc糖基化尚未见报道。O-GlcNAc糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,是由Gerald W.Hart首次发现。近年来,已经发现蛋白存在上百种翻译后修饰,其中糖基化修饰,尤其是O-GlcNAc糖基化修饰尤为引人注目。O-GlcNAc糖基化是一个动态可逆的过程,由乙酰氨基葡萄糖转移酶(β-N-acetylglucosaminyltransferase,OGT)负责糖基化,N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-Nacetylglucosaminidase,OGA)负责去糖基化。在生物体内,O-GlcNAc糖基化控制基本的生命过程,例如蛋白质的合成、染色质的结构、DNA脱甲基化以及生物昼夜规律。一些信号蛋白如AKT、转录因子如c-Myc、p53和NF-κB都存在O-GlcNAc糖基化修饰。近年来,大量文献都证明了 O-GlcNAc糖基化蛋白在多种癌变中发挥重要作用,如乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等,但并没有在pre-B-ALL进行相关研究。本研究选用临床初发的pre-B-ALL患儿骨髓标本及pre-B-ALL细胞系Nalm-6细胞作为主要研究对象,从糖生物学角度分析O-GlcNAc糖基化及相关酶OGT、OGA在B-ALL发生发展的作用,并从细胞糖酵解代谢的角度探讨其作用的机制。研究目的:1.研究O-GlcNAc糖基化及相关催化酶在pre-B-ALL儿童白血病细胞中的表达水平及对细胞生物学行为的影响。2.探索异常O-GlcNAc糖基化通过PI3K/Akt/c-Myc通路在Nalm-6细胞糖酵解过程的调控作用。3.探讨联合应用糖酵解抑制剂2-DG及靶向抑制OGT对Nalm-6杀伤效果的影响。研究方法:1.研究O-GlcNAc糖基化及相关催化酶在pre-B-ALL儿童白血病细胞中的表达水平及对细胞生物学行为的影响1.1.骨髓标本采集自从2015年9月至2016年9月期间就诊的pre-B-ALL初诊患儿。标本采集使用肝素抗凝试管,采集后立即应用淋巴细胞分离液依据密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells,BM-MNCs),用免疫磁珠进行阳性分选出CD19+的B淋巴细胞,流式细胞术检测分选纯度。1.2.采用Western-Blotting法检测pre-B-ALL患儿组和健康儿童组整体O-GlcNAc糖基化水平及OGT、OGA的蛋白表达水平。1.3以急性前B淋巴细胞白血病细胞系Nalm-6细胞为研究对象,分别应用小干扰RNA技术和OGT特异性抑制剂Alloxan处理Nalm-6细胞进行对生物学行为影响的检测。小干扰RNA法:合成针对OGT基因的siRNA(OGT-siRNA)和阴性对照的NC-siRNA,用 Lipofectamine2000 将 OGT-siRNA 和 NC-siRNA 转染至 Nalm-6细胞中,作用48h后,应用RT-PCR和Western-Bloting技术检测OGT的表达以及O-GlcNAc糖基化水平的变化以检测干扰效果。抑制剂法:以浓度为0、5、1Ommol/L的Alloxan作用于Nalm-6细胞24h后,Western-Bloting技术检测O-GlcNAc糖基化水平、OGT表达水平以验证Alloxan对OGT的抑制作用;验证抑制效果后,后续以以浓度为10mmol/L的Alloxan作用于Nalm-6细胞后以检测对生物学行为的影响。1.4 细胞增殖:采用 CCK-8 检测抑制 OGT(OGT-siRNA or Alloxan)24h、48h、72h、96h的波长为450nm处的吸光度值,并绘制相应的增殖曲线。1.5细胞凋亡:以AnnexinV-PI双染法标记,用流式细胞术检测OGT-siRNA作用48h,Alloxan作用24h时的细胞凋亡比例。2.探索异常O-GlcNAc糖基化通过PI3K/Akt/c-Myc通路在Nalm-6细胞糖酵解过程的调控作用2.1验证c-Myc受PI3K/Akt通路调控:使用不同浓度(0、1、5、10μmol/L)的LY294002(PI3K/Akt 通路抑制剂)处理 Nalm-6 细胞 48h 后,以 Western-Blotting法检测 Akt、磷酸化 Akt(AktSer473)、c-Myc、磷酸化 c-Myc(c-MycThr58)的蛋白表达情况。2.2比较低血清乳酸脱氢酶(L-LDH)的ALL患儿组CD19+细胞及血清乳酸脱氢酶(H-LDH)患儿组的PI3K/Akt/c-Myc的激活情况:以400u/L为分界点区别L-LDH组与H-LDH组,检测方法同2.1。2.3糖酵解活跃度检测:以不同浓度(0、1、5、10μmol/L)的LY294002处理Nalm-6细胞48h,用seahorse XFe24细胞能量分析仪检测细胞外酸化率(the extracellular acidification rate,ECAR),并统计分析 ECAR 基础值(baseline)、糖酵解能力(glycolytic capacity)、糖酵解储备(glycolytic reserve)的变化。2.4分析L-LDH和H-LDH白血病患儿的O-GlcNAc糖基化水平和OGT、OGA的表达。2.5糖酵解活跃程度检测:将Nalm-6细胞分为三组:实验组,即转染OGT-siRNA组,称为OGT-siRNA组;阴性对照组,即转染negative control siRNA组,称为NC-siRNA组;空白对照组,即只加入等量转染试剂组,称为control组。检测以上三组的ECAR,具体同2.3。2.6糖酵解催化过程相关分子检测:用实时荧光定量PCR检测以上3组HK2、Glut1、HIF-1α、LDHA、PFK1的mRNA表达水平,以β-actin为内参进行统计学分析。2.7检测PI3K/Akt/c-Myc通路激活情况:检测以上三组的该通路关键分子的磷酸化水平,检测方法同4.1。2.8检测IGF-1对OGT-siRNA所导致的糖酵解抑制作用的影响:OGT-siRNA+IGF-1 组:同时将 OGT-siRNA 和 IGF-1 作用于 Nalm-6 细胞 48h,OGT-siRNA组:只应用OGT-siRNA作用Nalm-6细胞48h,control组只加转染试剂,糖酵解检测同4.3。3.探讨联合应用糖酵解抑制剂2-DG及靶向抑制OGT对Nalm-6杀伤效果的影响3.1检测2-DG对Nalm-6细胞O-GlcNAc糖基化及OGT的影响:以Western-Blotting 法检测不同浓度(0、2.5、5mmol/L)的 2-DG 对 O-GlcNAc 糖基化及OGT蛋白表达的影响。3.2检测联合应用2-DG及靶向抑制OGT对Nalm-6细胞增殖的影响:该部分分为3 组:2-DG 组为加 2-DG(2.5 mmol/L)处理组;2-DG+NC 组为 2-DG(2.5 mmol/L)及 NC-siRNA 处理组;2-DG+OGT-siRNA 组为联合使用用 2-DG(2.5 mmol/L)及OGT-siRNA处理组;检测增殖方法同1.4。3.3检测联合应用2-DG及靶向抑制OGT对细胞凋亡的影响:分组同3.2,以Annexin V-FITC染色结合流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:1.O-GlcNAc糖基化及相关催化酶在pre-B-ALL儿童白血病骨髓细胞中异常表达水平并影响Nalm-6细胞生物学行为1.1本研究共收集了 24例初发pre-B-ALL患儿和10例健康儿童的骨髓标本,两组的其年龄、性别的差别无统计学意义;采用免疫磁珠分选BM-MNCs的CD19+高达 90.47%。1.2和健康儿童组相比,B-ALL患儿组整体O-GlcNAc糖基化水平(p<0.01)及OGT明显升高(p<0.001)、OGA的蛋白表达水平降低(p<0.001),差异均具有统计学意义。1.3 合成了 OGT-siRNA 及 NC-siRNA,以 OGT-siRNA 转染 48h 后 Western-Bloting结果显示OGT的表达以及O-GlcNAc糖基化水平均明显下调,表明干扰其表达有效。以不同的Alloxan作用于Nalm-6细胞24h后,Western-Bloting技术结果显示O-GlcNAc糖基化水平、OGT表达水平逐渐降低,证明Alloxan可以用作OGT的抑制剂。1.4 CCK-8细胞增殖实验显示OGT-siRNA和Alloxan处理后Nalm-6细胞增殖明显减慢,差异均有统计学意义。1.5细胞凋亡实验显示:Alloxan可以诱导Nalm-6细胞凋亡[Alloxan组vs对照组(15.19±2.539)%对(21.91±4.105)%,P<0.05];同样的,OGT-siRNA 转染后Nalm-6细胞也出现凋亡[OGT-siRNA组vs对照组(21.72 ± 1.903%)对(11.07± 1.069%),p<0.05]。2.O-GlcNAc糖基化通过PI3K/Akt/c-Myc通路在Nalm-6细胞糖酵解过程的调控作用。2.1 LY294002可导致Nalm-6细胞中磷酸化的Akt(Akt Ser473/Akt)、磷酸化c-Myc(c-Myc Thr58/c-Myc)表达量明显下调,表明c-Myc是PI3K/Akt下游分子,LY294002可以抑制该通路的活性。2.2 Western-Blotting 法结果显示 H-LDH 患儿组的 CD19+BM-MNC 比 L-LDH 患儿组PI3K蛋白表达上调,Akt及c-Myc的磷酸化程度均上调,提示H-LDH患儿组中存在PI3K/Akt/c-Myc过度激活。2.3 Seahorse XF24细胞能量分析仪检测ECAR结果显示LY294002处理后的Nalm-6细胞的胞外酸化率ECAR及各项统计指标的发生明显变化,提示PI3K/Akt/c-Myc通路的抑制可下调胞内糖酵解水平。2.4临床样本分析结果:与L-LDH患儿相比,H-LDH患儿中O-GlcNAc糖基水平更高,OGT表达增高,但OGA的表达并未有明显差别。2.5糖酵解活跃程度检测:ECAR结果显示,与control组相比,OGT-siRNA组的ECAR水平及相关指标均明显下调,而组和NC-siRNA组无明显差异;2.6糖酵解催化过程相关分子表达:实时荧光定量PCR结果显示干扰OGT表达可以下调 HK2、HIF-1α、LDHA、PFK1 的 mRNA 表达(p<0.05),但 Glut1 无明显变化。2.7 PI3K/Akt/c-Myc通路激活情况:干扰OGT表达后PI3K的蛋白表达下调,Akt、c-Myc的磷酸化水平均下调,提示干扰OGT可以抑制PI3K/Akt/c-Myc通路激活。2.8糖酵解活跃程度检测:OGT-siRNA+IGF-1组较OGT-siRNA组糖酵解水平升高,表明激活PI3K/Akt通路可以拮抗干扰OGT所致的糖酵解抑制作用。3.联合应用糖酵解抑制剂2-DG及靶向抑制OGT可增强对Nalm-6杀伤效果3.1 Western-Blotting结果显示经过2-DG处理后,Nalm-6细胞O-GlcNAc糖基化及OGT逐渐下调。3.2 CCK-8结果显示:2-DG+OGT-siRNA组的OD值明显低于其他3组,说明联合应用2-DG及靶向抑制OGT可以加强对Nalm-6细胞增殖抑制的影响。3.3细胞凋亡实验结果示2-DG+OGT-siRNA组的细胞凋亡比例明显高于其他3组,差异有统计学意义。结论:1.在pre-B-ALL患儿的CD19+BM-MNC中存在过度的O-GlcNAc糖基化修饰以及关键催化酶OGT表达的升高,尤其是在高血清LDH的患儿中。2.干扰OGT从而降低O-GlcNAc修饰水平可以降低PI3K/Akt/c-Myc通路中重要信号蛋白的磷酸化水平,进而影响细胞糖酵解的代谢过程。3.靶向糖酵解过程关键酶、干扰抑制OGT的表达及两者联用均可以阻遏Nalm-6细胞的增殖,促进凋亡,这对于儿童白血病的治疗有极其重要的理论指导意义。