目的恶性肿瘤严重危害人类健康和生存,是引起死亡的主要原因之一。阿霉素作为一种广谱抗肿瘤药物,在临床上主要用于治疗乳腺癌、儿童实体瘤、软组织瘤、恶性淋巴癌等多种恶性肿瘤。长期应用易出现耐药性并对正常组织器官,如心脏、肾脏、骨髓等具有明显的毒副作用。本研究以阿霉素为研究对象,依据前体药物的设计理念,选择具有肿瘤靶向呈递作用的大分子或小分子化合物,设计合成出一系列具有肿瘤靶向性的阿霉素前体药物;通过核磁、质谱、红外、液相色谱等手段,确定其分子结构及其体外释药特性。利用肿瘤细胞体外实验和荷瘤小鼠的体内实验,结合阿霉素具有荧光的特点,采用荧光显微镜和流式细胞仪等检测分析方法,观察设计合成的目标化合物(阿霉素前体药物)的肿瘤靶向性及体内、外抗肿瘤效应;通过HPLC-MS-MS方法,考察前体药物的药代动力学及组织分布特性;为增强阿霉素的疗效,降低其毒副作用提供一定的实验依据和理论基础,为研发新型阿霉素抗肿瘤制剂开辟新的思路。方法合成一系列阿霉素前体药物,在氮气保护下进行化学反应,反应过程及产物均用TLC监控,点硅胶板在紫外灯下观察反应进度及产物纯度。通过高锰酸钾将聚乙二醇6000(PEG)氧化成聚乙二醇6000二酸(中间产物2);通过EDCI或DCC/DMAP的催化,将α-亚麻酸(LNA)或聚乙二醇6000二酸引入阿霉素(DOX)的3,-位氨基得到阿霉素和PEG或LNA的酰胺键连接物(PEG-DOX amid and DOX-LNA;即目标化合物1和3)。通过EDCI的催化,聚乙二醇6000二酸与肼基甲酸叔丁酯(BOC肼)反应生成聚乙二醇6000二酰肼(BOC保护)(中间产物4),去除BOC保护得到聚乙二醇6000二酰肼(中间产物5);通过EDCI的催化,将聚乙二醇6000二酰肼引入阿霉素(DOX)的13-位羰基得到阿霉素和PEG的腙键连接物(PEG-DOX hydrazone;即目标化合物6);利用熔点仪检测目标化合物熔点,并分别进行1H NMR、MS、HPLC、IR等鉴定,以确定是否得到目标化合物。建立液相色谱条件,在选定的水解条件下将前药完全水解并对其进行定量分析,测定阿霉素-PEG连接前体药物的载药量,同时观察阿霉素前体药物在体外的释药性能。培养HepG-2(肝癌)、MCF-7和MDA-MB-231(乳腺癌)细胞株,将待测的各种药物(DOX、DOX-LNA、PEG-DOX amid、PEG-DOX hydrazone)按设定浓度分别与上述细胞孵育一定的时间,结合阿霉素具有荧光的特点,利用荧光显微镜观察药物在细胞内的分布,同时通过流式细胞仪半定量分析细胞对药物摄取的特点,并建立生物样品中HPLC-MS-MS检测阿霉素的方法,测定不同的肿瘤细胞对不同的前体药物摄取的差别。采用MTT法,结合细胞生长抑制率的公式,计算不同的药物对所选定的几种肿瘤细胞的半数抑制率(IC50),从而评价所设计合成的几种前药与阿霉素体外抗肿瘤活性的差别。采用透射电子显微镜,观察不同药物诱导细胞凋亡后细胞形态学的变化,评价前药及阿霉素诱导肿瘤细胞凋亡的活性。将培养至对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于裸鼠腋下,建立荷瘤动物模型,分别设立DOX阳性药组、DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone两种前体药物的大、中、小剂量和化学预防组,给予相应的处理,每天观察裸鼠的体重变化及肿瘤生长情况,根据公式计算肿瘤体积;试验结束后,处死动物,取下肿瘤组织称重,根据公式计算肿瘤生长抑制率,同时计算裸鼠存活时间和存活数,从而评价我们所设计合成的阿霉素前体药物的体外抗肿瘤活性;复制荷瘤裸鼠模型,设立DOX组、DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone两种前体药物组,给予药物后于2,8,24h处死动物,分别检测药物在肿瘤组织和正常组织中的含量,评价前体药物的肿瘤靶向性。SD大鼠静脉给予DOX,DOX-LNA,PEG-DOX amid,PEG-DOX hydrazone 5mg/kg, 0.08、0.17、0.5、1、2、4、8、12、24h后乙醚麻醉大鼠,腹静脉采集血样(肝素抗凝),3000rpm离心10min,分离血浆;并于给药0.5、2、8、24h后处死动物,取心,肝,脾,肺,肾组织,称重,匀浆备用。通过高效液相色谱-质谱连用(HPLC-MS-MS)方法,采用电喷雾电离负离子模式( ESI- ),多反应监测(MRM)方式检测静脉给予阿霉素或其前药后,大鼠血浆和组织中阿霉素浓度随时间变化的规律,计算并分析上述药物在大鼠体内代谢的药物动力学参数。结果按照预先设计的路线,我们成功合成了3个阿霉素前体药物,其中目标化合物1为暗红色粉末,熔点91℃,产率为73%。核磁数据为δ7.8 (2H, d, CH-2 and CH-4), 7.4 (1H, d, CH-3), 5.50 (1H, s, CH-1’), 4.08 (3H, s,H3C-O-C-1),δ5.28–5.49 (6H, m,CH-9,10,12,13,15 and 16), 2.81–2.78 (4H, m, CH2-11 and CH2-14)。质谱测得准分子离子峰为m/z=802.8([M-H]-),红外结果显示其结构与目标化合物一致;目标化合物3为暗红色粉末,熔点82℃,产率为87%,阿霉素载药量为3.9%。核磁数据为δ7.8 (2H, d, CH-2 and CH-4), 7.2 (1H, d, CH-3), 5.40 (1H, s, CH-1’), 4.10 (3H, s,H3C-O-C-1),δ3.61 (PEG骨架),红外结果显示其结构与目标化合物一致;目标化合物6为暗红色粉末,熔点78℃,产率为82.5%,阿霉素载药量为10.64%。核磁数据为δ7.1 (2H, d, CH-2 and CH-4), 6.8 (1H, d, CH-3), 5.30 (1H, s, CH-1’), 4.08 (3H,s,H3C-O-C-1),δ3.61 (PEG骨架),红外结果显示其结构与目标化合物一致。建立了阿霉素的高效液相色谱检测方法,在选定的色谱条件下,待检测药物阿霉素的色谱峰峰形好,不受杂质峰和溶剂峰的干扰,保留时间为3.79min,空白溶剂在该色谱条件下无特异吸收峰,色谱分析方法简便可行,重复性好,稳定可靠。线性范围为0.5-100μg/mL,最低检测限可达0.1μg/mL,日内,日间精密度(RSD)均小于15%。阿霉素前体药物体外释药研究结果显示,PEG-DOX hydrazone具有酸敏性,在偏酸性环境下释放较多,中性环境下较稳定,而PEG-DOX amid不具有酸敏活性,在中性及酸性环境下释药性能均不如PEG-DOX hydrazone。荧光显微镜结果表明,游离阿霉素与肿瘤细胞共孵育后仅有少量药物进入细胞内,而阿霉素三种前体药物在细胞内浓度均高于游离阿霉素,其中PEG-DOX amid在细胞内蓄积量最少,DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone在细胞内分布及蓄积量要高于PEG-DOX amid。细胞摄取实验结果表明,与阿霉素相比,前体药物进入细胞的量明显增加,并具有一定的时间依赖性。其中HepG-2对药物摄取量的峰值最高,MCF-7最低。大分子前药与细胞分别孵育24、48、72h后,发现肿瘤细胞对大分子前药的摄取呈现时间和剂量依赖性。MTT结果显示,前药对HepG-2、MCF-7、MDA-MB-231细胞均有一定的细胞毒性,且呈现良好的剂量依赖性。DOX-LNA的IC50值低于阿霉素组,而PEG-DOX amid和PEG-DOX hydrazone的IC50值高于阿霉素组。此外,大分子前药的体外细胞毒性还呈现出一定的时间依赖性,孵育时间越久,IC50值越低,抗肿瘤活性越好。透射电镜结果显示,前药对HepG-2、MCF-7、MDA-MB-231细胞均有一定的诱导凋亡作用,其中DOX-LNA的诱导作用高于阿霉素组,而PEG-DOX amid和PEG-DOX hydrazone的活性则低于阿霉素组。成功建立了荷瘤裸鼠动物模型,实验发现DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone治疗组动物体重变化与给药剂量均呈反比,给药剂量越大,动物体重增长越缓慢,而DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone化学预防组动物体重增长较其治疗组明显。前药能抑制肿瘤体积的增长,延长动物生存时间,呈现一定的抗肿瘤活性,且具有良好的剂量依赖性,其中化学预防处理组抗肿瘤活性好于治疗组,DOX-LNA的抗肿瘤活性优于PEG-DOX hydrazone。靶向性实验研究显示,DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone均能增加药物在肿瘤组织的分布,降低阿霉素在正常组织尤其是心脏中的分布,具有一定的肿瘤靶向性,符合设计要求。药动学及组织分布实验证实,前体药物可延长阿霉素的半衰期,减少正常组织尤其是心脏中阿霉素的含量,其中PEG-DOX amid和PEG-DOX hydrazone具有一定的缓释特性。结论设计合成了三个阿霉素前体药物,通过核磁,质谱,红外等分析证实其结构符合设计目标。两个大分子前药能够释放出阿霉素,释放速度缓和,释放时间长。PEG-DOX腙键连接的前药(化合物6)具有酸敏活性,达到预期设计目标。前体药物可增加细胞对阿霉素的摄取,提高细胞内的药物浓度。DOX-LNA的细胞毒性高于DOX,而PEG-DOX amid和PEG-DOX hydrazone的IC50高于原药。前体药物可诱导肿瘤细胞凋亡,影响细胞的生长调控。DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone可剂量依赖性抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长,延长动物存活时间,降低DOX对动物体重的影响,呈现肿瘤靶向性,降低药物的系统毒性。PEG-DOX amid和PEG-DOX hydrazone的半衰期明显延长,呈现缓释特性。