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目的:通过模拟腹腔镜CO2气腹环境,研究CO2气腹对肾透明细胞癌细胞转移相关基因和蛋白表达的影响和时间效应,及其对细胞增殖和凋亡的影响,从而探讨腹腔镜手术治疗肾脏肿瘤的安全性。
材料和方法:选用人肾透明细胞癌细胞株(RCC-949),采用自制培养瓶,在99%CO2和21℃条件下模拟腹腔镜CO2气腹环境干预RCC-949细胞。
第一部分:模拟CO2气腹环境对RCC-949细胞干预后,应用Western blotting和real time RT-PCR检测缺氧诱导因子-1α,(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和E-钙粘连蛋白(E-cadherin) mRNA和蛋白的表达变化;通过相关性分析,了解CO2气腹环境下HIF-1α与肿瘤转移相关mRNA和蛋白VEGF和E-cadherin的关系;并采用加入10μmol/L氯化钴(CoCI2)培养的RCC-949细胞作为缺氧阳性对照模型,以判别缺氧干预过程有无CO2的特殊作用。
第二部分:将CO2干预2h后的RCC-949细胞恢复常氧继续培养,再次行Western blotting和real time RT-PCR检测各mRNA和蛋白的表达变化,判断干预引起的肿瘤转移相关基因和蛋白变化的时间效应和可逆性,以评价其远期影响。
第三部分:在细胞整体水平,应用TUNEL法检测RCC-949细胞在CO2气腹环境干预后凋亡变化;应用噻唑蓝(MTT法)检测RCC-949细胞在CO2气腹环境干预后增殖变化。
结果:
第一部分:RCC-949细胞低氧培养1h后,HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白相对表达量便开始增加,并随低氧培养时间延长,其表达量逐渐增加;E-cadherinmRNA和蛋白相对表达量便开始下降,并随低氧培养时间延长,其表达量进一步下降。各低氧组中HIF-1α、VEGF、E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量,与正常对照组相比具有统计学差异(P<0.05),而与阳性对照组相比无统计学差异(P>0.05)。相关性分析结果显示:HIF-1α与VEGF mRNA表达水平的相关系数为0.938(P<0.01),两者成正相关;HIF-1α与E-cadherin mRNA表达水平的相关系数为-0.713(P<0.05),两者成负相关;HIF-1α与VEGF蛋白表达水平的相关系数为0.896(P<0.01),两者成正相关;HIF-1α与E-cadherin蛋白表达水平的相关系数为-0.657(P<0.05),两者成负相关。
第二部分:低氧培养2h后的RCC-949细胞恢复常氧继续培养,HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达水平均逐渐下降,而E-cadherin mRNA和蛋白表达水平均逐渐增加;且恢复常氧继续培养16 h后各指标均恢复至正常对照水平;同时还发现mRNA的表达恢复明显先于蛋白的表达恢复。
第三部分:模拟腹腔镜气腹环境对RCC-949细胞干预1h、2h、4h后,细胞的增殖和凋亡水平均轻度增加,但与正常对照组相比,不具有显著统计学意义(P>0.05)。
结论:模拟腹腔镜气腹环境对人肾透明细胞癌细胞RCC-949的影响是由缺氧介导的,并无CO2的特殊作用;RCC-949细胞在CO2气腹环境中VEGF mRNA和蛋白表达上调及E-cadherin mRNA和蛋白表达下调可能都是通过HIF-1α调控实现的;低氧培养2h后的RCC-949细胞恢复常氧培养后,HIF-1α、VEGF和E-cadherinmRNA及蛋白的表达变化是短暂的和可逆的;在4h之内,低氧环境对肿瘤细胞的增殖和凋亡没有明显影响。由此我们推测,2h之内的腹腔镜手术不会增加术后肿瘤种植转移的机会,腹腔镜手术对这些肿瘤的治疗是安全有效。