研究目的1.文献研究检索历年有关“轮状病毒性肠炎”(RVE)的文献,系统研究并总结国内外研究的动态,中西医对病毒性肠炎的诊疗进展,尤其是中医药治疗的独特优势。2.临床研究进行五加减正气散(WJJZQS)治疗小儿寒湿型RVE的临床疗效评价,分析经典古方五加减正气散在治疗寒湿型RVE中的治疗优势。3.实验研究进行五加减正气散含药血清作用于体外细胞染毒模型后其抗病毒机制的研究;并进一步检测其对IL-6、IL-1 β、TNF-α、IFN-β因子以及对TLR3信号通路关键蛋白的调控作用,探讨五加减正气散抗轮状病毒的免疫学机制。研究方法1.文献研究查阅国内外文献数据库,通过对RVE的相关文献检索,了解国内外研究动态,分别完成中医对RVE的研究进展综述(包括病名及沿革、病因病机、治则治法、辨证分型、中医治疗等),以及西医对RVE的研究进展综述(包括流行病学特征、RV的病原学特征、发病机制、临床表现及诊断、治疗方法等)。2.临床研究2.1研究对象研究对象来自2014年10月至2016年6月,山东中医药大学附属医院门诊及住院的中医诊断为寒湿型RVE的患儿,年龄6个月-3岁,病情属轻、中型,共计60例。按随机对照原则分为治疗组、对照组各30例。2.2治疗方法在常规饮食及生活调摄指导基础上,根据脱水情况对症应用ORS治疗外,治疗组应用《温病条辨》五加减正气散原方:藿香12g、苍术12g、陈皮10g、厚朴12g、大腹皮10g、茯苓18g、谷芽6g治疗。以上药物全部采用中药饮片,并由山东中医药大学附属医院药剂科代煎,每剂浓缩制成100ml/袋的液体。6个月-1岁每日20ml,1-2岁每日25ml,2岁以上每日35ml。分早晚两次,连服3天。对照组应用利巴韦林颗粒,50mg/粒,按15mg/kg·d剂量应用,分3次口服,连续3天。2.3观察指标通过治疗前后腹泻、腹痛、发热、呕吐、精神状态等临床表现观察,进行治疗前后中医症状积分、证候总积分、证候疗效、综合疗效、大便RV抗原转阴率、不良反应发生情况等比较,结合治疗前后三大常规、肝肾功、心电图等检查评估,完成五加减正气散治疗小儿寒湿型RVE的临床疗效评价。3.实验研究3.1实验材料病毒株与细胞株:轮状病毒SA11株(RV SA11),恒河猴胚胎肾细胞(MA104)为RVSA11株敏感细胞。动物:SPF级Wistar大鼠36只,体质量160g-200g,雌雄各半。药物:五加减正气散原方(同上)、利巴韦林颗粒、藿香正气口服液等。3.2含药血清制备36只Wistar大鼠适应性饲养7d后,按体质量随机分为:空白组、中成药组、西药组及WJJZQS大、中、小剂量组共6组,每组6只,雌雄各半。给药量按成人日用量等效剂量换算后,分别给予0.9%生理盐水、蕾香正气液、利巴韦林颗粒液、五加减正气散大、中、小剂量灌胃。每日分2次,连续3天。末次灌胃1h后取血。3.3 WJJZQS含药血清对RV SA11的体外抗病毒作用采用细胞病变法(CPE)检测WJJZQS含药血清(大、中、小剂量组)对MA104的最大无毒浓度(TC0)和RVSA11对MA104细胞的半数组织感染量(TCID50)。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法,在TC0范围内,检测WJJZQS含药血清对RVSA11的体外抗病毒作用。3.4 WJJZQS含药血清对TLR/TRIF/IRF3信号通路及下游因子的调控作用ELISA法检测细胞培养上清液中IL-6、IL-1 β、TNF-α、IFN-β的含量;RT-PCR法检测细胞中TLR3、TRIF、IRF3mRNA的表达情况;Western blot法检测细胞中TLR3、TRIF、IRF3蛋白的表达情况。研究结果1.文献研究中医多以“泄泻”论治RVE。以辨证论治为特色的中医药疗法应用广泛,且临床疗效确切,但缺乏有力的临床疗效评价及实验研究论证。西医在临床及基础研究方面虽取得了很多进展,但仍没有针对肠道病毒的特效药物,仅采取对症治疗。2.临床研究2.1病例基本情况治疗期间除对照组出现不良反应(轻度皮疹)脱落1例,余患儿均未出现不良反应,并坚持治疗至疗程结束,资料齐全。实际共收集病例59例,治疗组30例,对照组29例。2.2 一般资料比较两组性别分布、年龄分布、病情轻重比较均无显著性差异,具有可比性(P>0.05)。2.3治疗前后症状积分比较两组患儿治疗前各症状积分比较均无显著性差异(P>0.05)。治疗后两组症状积分均有不同程度降低,与对照组相比,除倦怠乏力、恶寒/发热积分差异不显著外(P>0.05),治疗组余症状改善程度均优于对照组,具有统计学意义(P<0.05)。其中腹泻、恶心呕吐、食欲不振改善明显优于对照组,差异特别显著(P<0.01)。2.4治疗前后证候总积分比较两组组内治疗前后证候总积分差比较,均具有统计学意义(P<0.05)。组间治疗前后证候总积分差比较,治疗组明显优于对照组(P<0.05)。2.5治疗后证候疗效比较两组总有效率比较,无统计学意义(P>0.05);两组显效率比较,具有统计学意义(P<0.05)。2.6治疗后综合疗效比较两组显效率比较,无统计学意义(P>0.05);两组总有效率比较,具有统计学意义(P<0.05)。2.7大便RV抗原转阴率比较两组大便RV抗原转阴率比较,治疗组明显优于对照组(P<0.05)。2.8不良反应发生情况比较对照组1例,服药1天后出现轻度皮疹,病例脱落。未予特殊处理2天后皮疹渐退。余两组患儿治疗前后均未出现不良反应及副作用,治疗前后肝、肾功,心电图等均正常。两组不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。3.实验研究3.1 RV SA11毒力测定RV SA11 对 MA104 细胞的 TCID50 10-3 34/ml:3.2含药血清的细胞毒性WJJZQS含药血清(大、中、小剂量组)对MA104细胞的TC0均为20%;3.3含药血清对病毒生物合成的抑制作用与同浓度空白血清组比较,除WJJZQS小剂量50%浓度组抑毒率差异不显著外(P>0.05),余各组抑毒率均优于空白血清组,具有统计学意义(P<0.05)。其中WJJZQS中剂量各浓度组抑毒率均明显优于空白血清组,差异特别显著(P<0.01)。与同浓度中成药组比较,除WJJZQS中剂量5%浓度组抑毒率明显优于中成药组外(P<0.05),余各组抑毒率与同浓度中成药组比较均无显著性差异(P>0.05)。与同浓度西药组比较,除WJJZQS小剂量各浓度组抑毒率明显低于西药组,差异显著外(P<0.05),余各组抑毒率与同浓度西药组比较均无显著性差异(P>0.05)。组内不同浓度多重比较结果,说明各组均能有效抑制RV合成,并呈现一定剂量依赖关系(P<0.05或0.01)。3.4含药血清抗病毒吸附试验除空白血清组在20%浓度抗病毒吸附率为4.04%外,其余各组含药血清的TC0范围内各浓度,对RV吸附的过程均没有明显的抑制作用(P>0.05)。3.5含药血清直接灭活病毒试验各组含药血清的TC。范围内各浓度,对RV均无直接灭活作用(P>0.05)。3.6 WJJZQS含药血清对染毒细胞IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β表达的影响病毒感染细胞后,各组IL-6表达量明显升高(与空白组比较P<0.01)。含药血清干预后,各组IL-6表达量较染毒组均不同程度降低。与染毒组比较,WJJZQS中剂量组、中成药组能明显下调IL-6的表达水平,差异特别显著(P<0.01);大剂量组亦可下调IL-6的高表达,且差异显著(P<0.05);WJJZQS小剂量组、西药组虽能使细胞IL-6的高表达降低,但与染毒组比较,无显著性差异(P>0.05)。病毒感染细胞后,各组IL-1β表达量明显升高(与空白组比较P<0.01)。含药血清干预后,各组IL-1β表达量较染毒组均不同程度降低。WJJZQS大、中剂量组下调IL-1β作用最强(P<0.01);其次为中成药、小剂量组(P<0.05);西药组对IL-1β表达无明显调控作用(P>0.05)。病毒感染细胞后,各组TNF-α表达量明显升高(与空白组比较P<0.01)。含药血清干预后,各组TNF-α表达量较染毒组均不同程度降低。WJJZQS小剂量组可明显下调TNF-α的高表达,差异显著(P<0.05);其余各组的调控作用则更强(依次为中成药组、西药组、WJJZQS中剂量、大剂量组),差异特别显著(P<0.01)。病毒感染细胞后,各组IFN-β表达量明显升高(与空白组比较P<0.01)。含药血清干预后,各组IFN-β表达量较染毒组均不同程度升高。WJJZQS中剂量组、中成药组上调IFN-β表达作用最强(P<0.01);WJJZQS大剂量组亦可上调IFN-β的表达(P<0.05);WJJZQS小剂量组、西药组对IFN-β表达无明显调控作用(P>0.05)。3.7 WJJZQS含药血清对染毒细胞TLR3、TRIF、IRF3 mRNA表达的影响病毒感染细胞后,TLR3mRNA明显升高(与空白组比较P<0.01),含药血清干预后,各组TLR3mRNA表达量较染毒组均不同程度降低。其中WJJZQS大、中剂量组可明显下调TLR3mRNA的过表达(P<0.01),WJJZQS小剂量组、中成药组、西药组均有不同程度的下调TLR3mRNA表达的作用(P<0.05)。病毒感染细胞后,TRIFmRNA明显升高(与空白组比较P<0.01),含药血清干预后,各组TRIFmRNA表达量较染毒组均不同程度降低。其中以WJJZQS中剂量组、中成药组下调作用尤为显著(P<0.01)。WJJZQS大剂量组也可显著下调TRIFmRNA的过表达(P<0.05)。WJJZQS小剂量组、西药组调控作用不明显(P>0.05)。病毒感染细胞后,IRF3mRNA表达量虽较空白组升高,但经统计学分析无显著性差异(P>0.05)。含药血清干预后,虽各组IRF3mRNA表达较染毒组均不同程度降低,但下降幅度小于1.5倍,不具有统计学意义(P>0.05)。故各组含药血清对IRF3mRNA的表达无明显调控作用。3.8 WJJZQS含药血清对染毒细胞TLR3、TRIF、IRF3蛋白表达的影响病毒感染细胞后,TLR3蛋白表达明显升高(与空白组比较P<0.01)。含药血清干预后,各组TLR3蛋白表达量较染毒组均有不同程度降低。其中WJJZQS大、中剂量组较染毒组显著降低(P<0.01),WJJZQS小剂量组、中成药组、西药组TLR3蛋白表达量亦有不同程度降低(P<0.05)。病毒感染细胞后,TRIF蛋白表达明显升高(与空白组比较P<0.01)。含药血清干预后,各组TRIF蛋白表达量较染毒组均有不同程度降低。其中WJJZQS中剂量组、中成药组较染毒组显著降低(P<0.01),WJJZQS大剂量组TRIF蛋白表达量亦显著降低(P<0.05);WJJZQS小剂量组、西药组虽蛋白表达量减少,但差异不显著(P>0.05)。病毒感染细胞后,IRF3蛋白表达量虽较空白组升高,但经统计学分析,无显著性差异(P>0.05)。含药血清干预后,虽各组IRF3蛋白表达量较染毒组不同程度降低,但经数据分析,亦无统计学意义(P>0.05)。研究结论1.文献研究中医药在治疗RVE临床疗效确切,但缺乏有力的临床疗效评价及实验研究论证。2.临床研究WJJZQS可明显改善寒湿型RVE患儿腹泻、腹痛/肠鸣、恶心呕吐、脘腹闷胀、食欲不振症状积分,尤其是腹泻、恶心呕吐、食欲不振改善程度明显优于对照组。而倦怠乏力、恶寒/发热改善程度与对照组相当。治疗前后证候总积分、证候疗效(显效率)、综合疗效(总有效率)、大便RV抗原转阴率等方面,明显优于对照组。WJJZQS治疗寒湿型RVE,安全有效,值得深入研究并临床推广应用。3.实验研究(1)WJJZQS具有的抗病毒作用,不是通过抗病毒吸附和对病毒的直接杀灭作用实现的,其抗病毒作用可能是通过抑制病毒进入细胞后的病毒生物合成作用。(2)WJJZQS通过下调IL-6、IL-1β、TNF-α等致炎因子的过表达,上调抑炎因子IFN-β的表达,发挥辅助的抗病毒作用。(3)WJJZQS对特异性识别dsRNA病毒的TLR3信号通路关键蛋白TLR3、TRIF表达有一定的调控作用,但对IRF3的表达则无显著调控作用。