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本试验以下胚轴、叶柄、叶片、子叶和根为外植体,以附加30.0g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基为基本培养基,研究了北美独行菜的离体植株再生和根癌农杆菌介导的除草剂bastar的抗性基因bar基因的转化技术。结果表明:在愈伤组织的诱导上,BA和2,4-D的组合对愈伤组织最为有利,对于以上的所有外植体,诱导频率都在95%以上,愈伤组织生长迅速;BA和NAA的组合对各外植体愈伤组织的组合诱导效率则因外植体的不同有很大的不同:其中下胚轴诱导效率最高,叶柄的愈伤组织的诱导频率位居其次,但这两者愈伤组织的生长明显比带有2,4-D的培养基的愈伤组织生长慢。叶片和子叶在BA(0-2mg/L)+NAA(0-2mg/L)范围内均不到20%。根在以上含NAA的培养基中均没有愈伤组织产生。
在愈伤组织的再生研究中,以BA+NAA诱导的愈伤组织在含有BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L的基本培养基容易再生出苗,但只要是经2,4-D诱导的愈伤组织在含有或不含2,4-D的培养基中均不能再生出苗。在其中添加2-30mg/L的AgNO3的情况下,可以明显看出愈伤组织的变化,有少数的苗再生出来,但比例很低。
用含pCAMBIA2300bar质粒的根癌农杆菌LBA4404和新鲜的烟草叶片在含BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L液体基本培养基中感染叶柄愈伤组织和带腋芽的叶5-15min后,将愈伤组织和烟草叶片一起转到含同样激素固体基本培养基上共培养2-5d;然后将愈伤组织转到含头孢霉素500mg/L和卡那霉素40mg/L的选择培养基上培养;将叶转到含头孢霉素500mg/L和卡那霉素50mg/L,另加BA1.0mg/L选择培养基上培养。经过几代选择后,从再生小苗叶片中抽取总DNA,并以此为模板,用bar基因引物对其进行PCR扩增,结果为阳性,证明其为转化得到再生的小苗。