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桑叶（Mori Folium）为桑科（Moraceae）植物桑（Morus alba L.）的干燥叶,是一种药食两用的植物资源。桑叶在古代本草文献中就有记载用于“止消渴”,即现代防治糖尿病的作用,其中以1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin,DNJ）为主的多羟基生物碱是桑叶中具有降血糖作用的主要活性成分之一。DNJ是一种强效的α-糖苷酶抑制剂,具有降血糖、抗肿瘤、抗病毒等功效,开发以DNJ为有效成分的保健食品和药品具有广阔的应用前景。天然来源的DNJ在桑叶中最为丰富,但也含量较低,传统分离制备方法难以大量获取天然的DNJ。随着合成生物学的发展,合成生物学技术有望为大量获取天然DNJ提供新方法。DNJ是来源于赖氨酸的哌啶类生物碱,目前完整的DNJ生物合成途径尚未完全解析。本课题组前期研究推测了桑叶中DNJ的生物合成途径,对桑叶中赖氨酸脱羧酶和铜胺氧化酶进行了克隆和功能验证,阐明了桑叶中DNJ由赖氨酸到Δ~1-哌啶烯的合成途径,但由Δ~1-哌啶烯到哌啶及其甲基化和羟基化的过程都未解析。本论文主要研究了DNJ生物合成途径中Δ~1-哌啶烯到哌啶的还原过程,筛选出三条还原酶候选基因Ma SDR1、Ma SDR2和Ma P5CR1,对其进行了克隆、表达和体外功能验证,并构建了农杆菌介导桑的遗传转化体系,采用基因过表达技术和病毒诱导基因沉默技术（virus induced gene silencing,VIGS）进行了体内功能验证,揭示了桑叶DNJ从Δ~1-哌啶烯还原生成哌啶的生物过程,解析了桑叶中DNJ生物合成从Δ~1-哌啶烯到哌啶的途径,为桑叶中DNJ生物合成途径全解析及实现合成生物学生产DNJ类多羟基生物碱奠定基础。主要研究内容和结果如下:1.桑叶DNJ生物合成途径关键还原酶基因的筛选。采用比较转录组方法分析不同生长季节中DNJ含量最高的桑叶样本（M7）和DNJ含量最低的桑叶样本（M11）的转录组数据（SRA登录号:SRP127713）,转录组数据中涉及DNJ生物合成途径上由Δ~1-哌啶烯生成哌啶可能的碳氮双键还原酶基因共筛选到124条,分别编码短链脱氢酶（short-chain dehydrogenase/reductase,SDR）和Δ~1-吡咯啉-5-羧酸还原酶（delta1-pyrroline-5-carboxylic acid reductase,P5CR）,其中相关的还原酶差异基因10条,9条下调、1条上调。分析不同生长季节的桑叶中还原酶差异基因表达水平与DNJ含量的相关性,结果表明Ma SDR1、Ma SDR2和Ma P5CR1基因表达水平与DNJ含量均呈显著正相关,推测Ma SDR1、Ma SDR2和Ma P5CR1是桑叶中DNJ生物合成途径上催化Δ~1-哌啶烯生成哌啶的还原酶候选基因。2.桑叶DNJ生物合成途径还原酶基因Ma SDR1、Ma SDR2和Ma P5CR1克隆及表达。从桑叶里克隆得到还原酶基因Ma SDR1（Gen Bank accession:MT989445）、Ma SDR2（Gen Bank accession:MT989446）和Ma P5CR1（Gen Bank accession:MT989447）。生物信息学分析结果显示,Ma SDR1和Ma SDR2基因编码蛋白与短链脱氢酶（PDB ID:6y4d.1.A）相似度为93%和99%,属于短链脱氢酶家族;Ma P5CR1基因编码蛋白与Δ~1-吡咯啉-5-羧酸还原酶（PDB ID:5bse.1.A）相似度为100%,属于PLN02688家族,这两个家族的酶均可能对碳氮双键起还原作用。多重序列比对结果表明,Ma SDR1和Ma SDR2具有TGXXXGX辅因子结合基序,Ma P5CR1具有Δ~1-吡咯啉-5-羧酸还原酶家族的保守结构域。系统发育树结果表明Ma SDR1、Ma SDR2和Ma P5CR1均与川桑（Morus notabilis）的同源性最高。采用双酶切与连接法分别构建了重组质粒Ma SDR1/p ET28a（+）、Ma SDR2/p ET28a（+）和Ma P5CR1/p ET28a（+）,经过PCR和测序验证成功后,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,由诱导剂IPTG成功诱导表达出重组蛋白,重组蛋白均为可溶性蛋白,分子量均在34 k Da左右,运用His标签法得到了纯化蛋白。3.桑叶DNJ生物合成途径还原酶Ma SDR1、Ma SDR2和Ma P5CR1体外功能研究。采用体外酶促反应验证了还原酶Ma SDR1、Ma SDR2和Ma P5CR1的功能,结果表明,Ma SDR1和Ma SDR2在辅酶NADPH,Ma P5CR1在辅酶NADH的辅助下均能催化底物Δ~1-哌啶烯生成哌啶。Ma SDR1对底物Δ~1-哌啶烯的Km值和Vmax值分别为82.52μmol/L和11.55μmol/L/min,Ma SDR2对底物Δ~1-哌啶烯的Km值和Vmax值分别为60.61μmol/L和24.65μmol/L/min,Ma P5CR1对底物Δ~1-哌啶烯的Km值和Vmax值分别为84.79μmol/L和23.67μmol/L/min,Ma SDR1和Ma SDR2的酶动力学参数表明,Ma SDR2对Δ~1-哌啶烯的亲和能力高于Ma SDR1。不同生长季节的桑叶中还原酶基因Ma SDR1、Ma SDR2和Ma P5CR1的表达水平与DNJ含量呈显著正相关,表明Ma SDR1、Ma SDR2和Ma P5CR1可能是DNJ类多羟基生物碱生物合成的关键还原酶基因,可能对DNJ生物合成具有调控作用。4.桑叶DNJ生物合成途径还原酶基因Ma SDR1、Ma SDR2和Ma P5CR1体内功能研究。采用C58C1农杆菌介导构建桑的过表达遗传转化体系及GV3101农杆菌介导构建桑的VIGS转化体系验证桑叶DNJ生物合成途径还原酶基因Ma SDR1、Ma SDR2和Ma P5CR1的体内功能。通过双酶切与连接转化法分别获得农杆菌O-Ma SDR1/p BI121-EGFP/C58C1、O-Ma SDR2/p BI121-EGFP/C58C1和O-Ma P5CR1/p BI121-EGFP/C58C1,用于侵染桑无菌苗的外植体,经共培养、选择培养及扩大培养后,通过PCR鉴定为O-Ma SDR1、O-Ma SDR2和O-Ma P5CR1基因的阳性转基因毛状根,当O-Ma SDR1、O-Ma SDR2和O-Ma P5CR1基因过表达时,O-Control、O-Ma SDR1、O-Ma SDR2、O-Ma P5CR1对应的毛状根中DNJ平均含量依次为0.06、0.27、0.36和0.19 mg/g,转基因毛状根中DNJ的平均含量比非转基因毛状根中DNJ的平均含量均显著增加（P<0.001）。采用双酶切与连接转化法分别获得农杆菌V-Ma SDR1/p TRV2/GV3101、V-Ma SDR2/p TRV2/GV3101和V-Ma P5CR1/p TRV2/GV3101,用于侵染桑无菌苗,通过PCR鉴定出阳性VIGS桑叶,当V-Ma SDR1、V-Ma SDR2和V-Ma P5CR1基因沉默时,V-Control、V-Ma SDR1、V-Ma SDR2、V-Ma P5CR1对应的VIGS桑叶中DNJ平均含量依次为0.19、0.14、0.14和0.15 mg/g,VIGS桑叶中DNJ平均含量比非VIGS桑叶中DNJ平均含量均显著减少（P<0.001）。以上结果进一步表征了还原酶基因Ma SDR1、Ma SDR2和Ma P5CR1在桑叶DNJ生物合成过程中的调控作用,当这三条还原酶基因过表达时,DNJ含量随之增加,当沉默这三条基因时,基因表达受阻,DNJ含量随之减少,说明这三条基因参与DNJ的生物合成,是桑叶DNJ生物合成途径关键还原酶基因,为进一步研究桑叶中DNJ哌啶环的羟基化、甲基化,最终形成DNJ类多羟基生物碱奠定了基础。