为研究丝羽乌骨鸡体内黑色素合成和沉积的分子机制，本研究构建了丝羽乌骨鸡的基因组细菌人工染色体(BAC)文库。利用构建的BAC文库对Z染色体上黑色素相关基因酪氨酸酶相关蛋白1基因(TYRP1)的基因结构以及该基因的表达与黑色素沉积的关系进行了研究，同时构建了位于Z染色体上缺乏标记区段的表皮黑色素抑制因子基因(ID)的BAC重叠群。 (一) 本文构建了中国特有的丝羽乌骨鸡的BAC文库，结果如下： (1) 该文库共有138，240个BAC克隆(分为72个超级池，每个超级池由20块96孔板组成)。整个文库以两级3维的结构保存，建立了高效快速的PCR筛选系统。 (2) 对随机挑选的452个BAC克隆的插入片段进行鉴定估计文库的平均插入为118kb，文库的基因组覆盖率为13.34倍，预计从文库中筛选到单拷贝基因的机率为99.984％。用40个微卫星标记和8个功能基因对整个文库进行PCR筛选，得到的平均阳性克隆数分别为10.423和11.125。对32个BAC克隆的荧光原位杂交结果表明，文库的最大嵌合率为6％。对筛选得到的6个含LMBR1序列的BAC克隆酶切分析的结果表明BAC克隆之间是相互重叠的。 (二) 本文对Z染色体上与黑色素相关的基因TYRP1和ID的研究结果如下： (1) 获得了10，066bp的TYRP1的全长基因组序列，分析结果表明：丝羽乌骨鸡的TYRP1外显子与人的TYRP1外显子同源性为70.1％。鸡TYRP1基因比人TYRP1基因缺少1个内含子；内含子中有2个微卫星序列。利用内含子1中的微卫星对家系进行基因组扫描，卡方检验结果表明TYRP1与皮肤色和爪色显著相关(0.01＜P＜0.05)，和胫色极显著相关(P＜0.01)。用荧光原位杂交进行TYRP1的染色体定位，首次将TYRP1定位在Z和W染色体长臂近着丝粒的位置。 (2) 在丝羽乌骨鸡、白莱航鸡、绿壳蛋鸡和寿光鸡的TYRP1的7个外显子和内含子6中寻找SNP，比较PCR产物测序结果，只在内含子6中发现两个SNP。经过预测，发现其中的一个SNP可能使丝羽乌骨鸡的内含子6中出现了新的转录因子的结合位点。对丝羽乌骨鸡TYRP1内含子6中相对于其他3种鸡的突变序列进行的凝胶阻滞试验，证实了丝羽乌骨鸡的TYRP1在这个突变位置产生了与转录因子的结合位点。 (3) 用RT-PCR检测丝羽乌骨鸡0.5到16天胚胎各组织中TYRP1的表达，结果表明TYRP1在6天的鸡胚眼中开始表达，10天以后开始在其它组织依次表达。RT-PCR检测白莱航和乌骨鸡的8天、16天胚胎和出生后2天各组织的TYRP1表达，结合对表型的观察发现，乌骨鸡各组织中黑色素的沉积随TYRP1的表达出现，而白莱航(除肾脏外)只在有黑色素沉积的眼睛中表达TYRP1，其他组织既无TYRP1的表达也无黑色素沉积。可见TYRP1的表达与黑色素的沉积和分布是一致的。 (4) 以离ID最近的ACO1(aconitase 1，顺乌头酸酶)基因为起点，设计引物筛选含ACO1的BAC克隆，用染色体步行的方法得到16个BAC克隆。通过BAC指纹分析，构建起包含13个克隆，覆盖了387kb的BAC重叠群。通过荧光原位杂交确认了这个重叠群处于Z染色体末端。中国农业人学博卜学位论文摘要 本研究构建了中国特有鸡种丝羽鸟骨鸡基因组BAC文库并进行了文库质量鉴定，它所具有的13倍高基因组覆盖率、6%的嵌合率和部分重叠的克隆使其成为完善鸡的基因组图谱、研究基因功能和构建BAC重叠群的优质资源。其次，本文对首次测定的TYR尸了的全基因序列和SNP进行分析，发现丝羽鸟骨鸡的TJ坂Pj具有与其它鸡种不同的微卫星标记和转录调控位点，说明了y尺尸了的序列和sNP造成的表达调控的变化可能与乌骨鸡独特的黑色素沉积方式有关。通过对鸟骨鸡与自莱航鸡不同发育期胚胎的T圣’R尸了表达谱和对鸡胚的黑色素沉积时间和分布的观察，进一步证明了Tr尺Pj与黑色素沉积存在密切的关系，为研究丝羽鸟渭·鸡体内黑色素沉积的分子机理提出了新的假设和新的证据。最后，本文在ID基因区域进行染色体步行，构建了覆盖387kb的BAC重叠群，建_、父了构建染色体未知区域物理图谱的技术方法，为ID基因未来的定位和克隆打卜了良女r的基础。