[目的]对老年猕猴实施骨髓间充质干细胞(BMMSC,Bone marrow mesenchymal stem cells)治疗,通过基于质谱技术的生物样本数字化的数据非依赖性采集(DIA,Data independent acquisition)分析获得血清蛋白组学数据库,筛选出不同年龄及BMMSC治疗后老年猕猴的差异蛋白,揭示不同年龄及BMMSC治疗后老年猕猴血清蛋白成份和含量变化规律,比较分析差异蛋白的生物功能及信号通路,发现BMMSC治疗猕猴衰老的关键调控因子,寻找疗效评价指标。[方法]1.自然衰老猕猴模型评价老年组为6只23-25周岁的雌性猕猴,在本课题组研究心、肺、肾、脑等结构与功能退变的基础上,重点观察衰老猕猴表型如主动脉弓HE染色后形态结构特点的变化,同时观察老年猕猴面部特征,毛发的颜色数量。2.BMMSC的制备与鉴定无菌条件下肌肉注射3%戊巴比妥lmg/kg麻醉幼年猕猴,经骨髓穿刺术取骨髓,通过全骨髓组织贴壁法培养BMMSC原代细胞,纯化扩增至P4代用于实验。取P4代BMMSC镜下观察形态特征;流式分析BMMSC表面标志物CD29、CD34、CD90、CD105表达水平;对BMMSC进行成脂、成骨和成软骨功能诱导分化实验。3.猕猴分组及治疗实验动物分为4组:幼年组3只,青年组3只,老年组4只,治疗组4只,均为雌性。按1×107cells/kg经股静脉注射BMMSC,隔天输注1次,连续治疗3次,治疗结束后30d取静脉血进行血脂、肌酐等检测;治疗结束后180d取静脉血进行血脂、肌酐检测并实施解剖。4.猕猴血脂、肌酐检测及主动脉弓HE染色真空采血法分别取老年组,治疗后30d及180d猕猴股静脉全血分离血清进行血脂及肌酐检测;BMMSC治疗结束后180d,肌肉注射过量3%戊巴比妥处死猕猴,取治疗组及老年组猕猴主动脉弓HE染色观察形态结构特点。5.DIA蛋白组学分析真空采血法取四组猕猴股静脉全血离心获得血清进行DIA蛋白质组学分析观察各组血清蛋白表达情况,通过蛋白组学定量技术筛选出不同年龄及BMMSC治疗后的老年猕猴的血清差异蛋白,随后对差异蛋白进行Go(Gene Ontology)功能分析、KEGG(京都基因和基因组百科全书,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库通路分析等,根据检测结果筛选出最有意义的疗效评价指标。[结果]1.模型评价本实验成功筛选4只23-25周岁的自然衰老猕猴模型。本课题组同步进行影像学PET-CT全身扫描以及对肺、胸腺、心脏等进行HE染色、Masson染色、Tunel染色等观察到各个器官的结构与功能退变结果均符合自然衰老猕猴的表型;本实验观察到老年猕猴面部有红斑,面部周围以及背部毛发数量减少,毛发黯淡,光色度减低;主动脉弓HE染色发现明显块状蓝染现象,钙化明显,符合衰老猕猴的表型。2.BMMSC培养及鉴定镜下观察P4代BMMSC呈长梭形漩涡状,大小均一;成骨诱导经茜素红染色镜下观察阳性,成脂诱导经油红O染色镜下观察阳性,成软骨诱导经阿尔斯兰染色镜下观察阳性。流式分析P4代BMMSC表面标志物CD29、CD34、CD90、CD105,阳性表达率分别为:97.3%,1.5%,98.4%,99.8%。3.猕猴血脂、肌酐的检测及主动脉弓HE染色BMMSC治疗衰老猕猴30d及180d后均降低了低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C,low density lipoprotein-cholesterol)、甘油三酯(TG,Triglyceride)/高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C,high density lipoprotein-cholesterol)、肌酐水平,升高了 HDL-C水平,提示BMMSC可以改善老年猕猴的血脂水平;治疗后180d主动脉弓HE染色均未发现钙盐沉积、细胞坏死等病理现象。4.DIA蛋白组学分析结果幼年组、青年组、老年组以及治疗组14个血清样本共检测出1006种蛋白,筛选差异蛋白标准为p-value<0.05,Folld change绝对值>1.5,其中D组与C组对比检测出差异蛋白44个,上调差异蛋白11个,下调差异蛋白33个,上调差异蛋白如与血管衰老相关的软骨寡聚基质蛋白(COMP,Cartilage oligomeric matrix protein)、神经元衰老相关的微管蛋白α链(TUBA1A,Tubulin α chain)、与造血有关的与κ-B结合蛋白相关的核因子(NKAP,NF-κ-B-activating protein)等,下调差异蛋白如与神经元衰老相关的蛋白S100、与心血管疾病相关的脂质运载蛋白2(LCN2,Lipocalin 2)、与肿瘤相关的集落刺激因子1受体(CSF1R,Colony stimulating factor 1 receptor)和冠蛋白(CORO1C,Coronin)等;D 组与A组比,检测筛选出差异蛋白83个,上调差异蛋白43个,下调差异蛋白40个,上调差异蛋白如与代谢相关的TBC1域家族成员2(TBC1D2,TBC1 domain family member 2)、与生殖功能相关的精子发生相关因子18(SPATA18,Spermatogenesis associated 18)等,下调差异蛋白如COMP、与炎症相关的骨膜蛋白(POSTN,Periostin)等;B组与A组相比筛选出差异蛋白80个,上调差异蛋白38个,下调差异蛋白42个,上调差异蛋白如与肿瘤相关的Ras抑制蛋白1(RSU1,Ras suppressorprotein 1)、与神经元衰老相关的5’-3’核糖核酸外切酶(5’-3’exoribonuclease 1)等,下调差异蛋白如COMP、POSTN等;C组与A组相比检测筛选出差异蛋白90个,上调差异蛋白52个,下调差异蛋白38个,上调差异蛋白如与神经元衰老相关的差异蛋白葡萄糖-6-磷酸异构酶(G6PI,Glucose--6-phosphate isomerase)、免疫功能相关的蛋白壳多糖酶 3(CHI3L1,Chitinase 3 like 1)等,下调差异蛋白如与POSTN、COMP、免疫功能相关的免疫球蛋白λ5-52(IGL λ 10-54,Immunoglobulin lambda variable 10-54)等。[结论]1.本课题组成功筛选出4只23-25周岁老年猕猴作为自然衰老模型,通过影像学PET-CT、组织病理学分析发现老年猕猴胸腺萎缩,脂肪填充较多,肺部出现炎性细胞的浸润,心肌纤维化增加等;本实验研究发现衰老猕猴表现为毛色暗淡,面部红斑,主动脉弓局部钙化。2.全骨髓贴壁培养法分离培养获得P4代BMMSC,呈长梭形漩涡状,大小均一,CD29、CD90、CD105呈阳性表达,CD34阴性表达,纯度高,具有成脂成骨成软骨分化潜能。3.BMMSC治疗老年猕猴30d及180d后显著降低了治疗组LDL-C、TG/HDL-C、肌酐表达水平,增高了 HDL-C表达水平,这说明BMMSC改善了老年猕猴的血脂水平表达,提示LDL-C、TG/HDL-C、HDL-C可能作为评价BMMSC移植治疗老年猕猴疗效指标。4.BMMSC治疗老年猕猴后,反转了衰老相关的血清蛋白质组特征,治疗组血清蛋白表达情况倾向幼年组及青年组;与老年组相比,BMMSC治疗后血清中S100表达量明显降低(Fold change值=-20.55,p值<0.05);COMP在幼年、青年及老年阶段的表达量一直下降,经BMMSC治疗后表达水平增加并接近幼年阶段;与治疗组相比,老年组未检测到NKAP;与老年组相比,治疗组未检测到LCN2、CSF1R、CORO1C、CSTB;从幼年到青年到老年阶段中RSU-1表达量一直增加,而在BMMSC治疗后的血清标本中未检测到该蛋白,以上结果显示COMP、LCN2、S100、NKAP、CSF1R、CORO1C 等可能会作为 BMMSC 治疗衰老以及衰老相关疾病比如心血管疾病、肿瘤等备选标志物。