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本研究选用具有经济价值的象草作为分离材料,采用DN和Ashby无氮培养基,结合乙炔还原法,对象草内生固氮菌进行了分离,共得到内生固氮菌42株。通过SDS-PAGE全细胞蛋白电泳和HRM对获得的菌株进行聚类分析,初步聚为四个类群。在此基础上,对各类群的代表菌株做了以下工作:16SrDNA全序列分析,以确定菌株的系统发育;对环境的耐受性试验(抗生素、pH、渗透压);在不同环境因子(酸碱度、渗透压、铵离子)下固氮菌株的固氮特性;植物生长激素(IAA)分泌的测定;解磷实验;代表菌株组合发酵及对水稻的促生效果。得出以下结论:
1.内生固氮菌的筛选及鉴定:分离出内生固氮菌42株,采用SDS-PAGE和高分辨溶解曲线(HRM)分析技术相结合聚为4个类群,对代表菌株进行了16SrDNA序列分析,结果表明,类群Ⅰ为克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.),类群Ⅱ为为肠杆菌属(Enterobacter spp.),类群Ⅲ、Ⅳ分别植物细菌属(Phytobacter spp.)和固氮弧菌属(Azoarcus spp.)。86%的菌株属于类群Ⅰ和类群Ⅱ,为象草内生固氮菌优势菌群。
2.代表菌株的耐受性及固氮特性:菌株对抗生素、pH值、渗透压有一定的抗性,对氨苄青霉素的耐受性较强,在氨苄青霉素浓度为300μg/ml范围内,pH4~pH10,NaC1浓度5%以内基本能够正常生长。供试菌株固氮酶活性与渗透压、NH4+浓度、酸碱度有关,在NaC1浓度0.25%~1.5%、NH4+浓度0~2.5mmol、pH5~pH10范围内具有稳定的固氮酶活性。
3.生长素分泌与溶磷能力测定:定性和定量检测结果表明4个代表菌株都能不同程度地分泌植物生长激素(IAA),类群Ⅰ代表菌WY1分泌IAA的能力最强,其次为类群Ⅲ的SG2,群Ⅱ的SG4和类群Ⅳ的WB10分泌能力较弱。溶磷试验表明菌株WY1具有较好的解磷效果,其次SG2,菌株SG4、WB10效果较差,尤其是菌株WB10,几乎没有解磷效果。
4.固氮菌发酵及对水稻促生作用:挑选代表菌株以及实验室已有的固氮菌混合培养,变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测发现混合培养24h~96h内菌群结构稳定,SG2、SG4为组1中优势菌,WY1为组2、3中优势菌。以甘蔗渣为主要培养基质固体发酵,用发酵产物作为肥料进行水稻盆栽实验,探讨菌株对水稻生长的影响。结果表明,各菌肥处理组不如施用复合肥效果好,但与阴性对照(培养基阴性对照)相比,除处理组4(单菌WY1)外,均不同程度促进水稻株高,增加范围在8.47%~14.95%之间;施加菌肥后,水稻植株全氮含量有所增加,尤其是处理组1、组5,全氮含量分别增加32.4%和90.2%。菌株SG2促生效果突出,具有潜在的应用价值。如何进一步优化发酵条件,增加微生物肥料的促生作用,使其在功能上超过复合肥料,还需要进行更深入的研究。