HMGB1是一种在哺乳动物中广泛表达的核蛋白,在核内结合于染色体,起到调节基因表达的作用;分泌到核外,能调节免疫细胞间的信号传递,募集免疫细胞,参与炎症反应。HMGB1也参与肿瘤的发生和进展。它通过与细胞表面AGER的结合,促进肿瘤细胞的增殖、转移及肿瘤新生血管形成。另一方面,研究发现,在放化疗时,HMGB1从正在死亡的肿瘤细胞中大量释放,结合于DCs表面TLR4体,激发DCs,使其吞噬、处理并呈递肿瘤抗原,激发T淋巴细胞介导的抗肿瘤作用。HMGB1在多数恶性肿瘤中表达上调,但在肺癌中表达的情况还没有报道。本研究收集了63例非小细胞肺癌组织,检测了HMGB1的表达,并用HMGB1诱导DCs生长,验证了其诱导免疫细胞杀伤A549细胞的能力。　　 第一部分、HMGB1在非小细胞肺癌中表达情况的研究　　 目的：了解HMGB1在非小细胞肺癌中的表达情况。　　 方法：　　 1.收集63例非小细胞肺癌临床病例,留取癌组织和正常肺组织。　　 2.realtime-PCR法定量检测HMGB1 mRNA水平的表达。　　 3.western-blot法半定量检测HMGB1 protein水平的表达。　　 4.免疫组织化学法检测HMGB1 protein的表达。　　 结果：　　 1.肺癌中HMGB1 mRNA的相对表达量(HMGB1/GAPDH,mean+SD)为1.09±0.53,相应正常肺组织中为2.24±1.14,正常肺组织对照中为2.15±1.76。肺癌组织中HMGB1 mRNA的表达量明显低于相应正常肺组织和正常对照,单因素方差分析显示差异显著(p＜0.001)。配对t检验显示肺癌中HMGB1 mRNA的表达显著低于相应正常肺组织(p＜0.001)。　　 2.肺癌中HMGB1 protein的相对表达量(HMGB1/β-actin,mean±SD)为0.64±0.43,相应肺组织中为0.90±0.54,正常肺组织对照中为0.91±0.55。配对t检验显示HMGB1 protein在肺癌中的表达显著低于相应正常肺组织(p＜0.004)。肺癌中HMGB1 protein的表达亦低于正常对照,但单因素方差分析显示差异不显著(p=0.073)。　　 3.HMGB1表达下调与NSCLC进展相关:Ⅲ-Ⅳ期肺癌组织中HMGB1 mRNA的表达量显著低于Ⅰ-Ⅱ期肺癌组织(p=0.005)。以其他临床特征作为因子分析HMGB1的表达,未发现有显著差异。　　 4.正常肺组织中,肺泡上皮、肺间质细胞核染色呈强阳性,而细胞质中等程度阳性。在肿瘤组织中,只有细胞核染色呈阳性。　　 结论：　　 1.非小细胞肺癌中,HMGB1表达下调。　　 2.HMGB1 mRNA表达下调的程度与临床分期相关。　　 第二部分、HMGB1在肺癌中的表达下调原因的初步分析　　 目的：检测HMGB1基因启动子区是否存在异常甲基化,探索HMGB1在非小细胞肺癌中表达下调的原因。　　 方法：　　 1.Methyl Primer Express@Software Ver.1.0软件分析HMGB1基因的序列,在启动子区发现一个2000bp的CpG岛,选择一对由软件设计的引物。　　 2.选取12例非小细胞肺癌组织,提取肺癌基因组DNA。　　 3.MSP实验分析CpG岛是否存在异常甲基化。　　 结果：所有转化后的DNA样品经检测,U均为阳性,M均为阴性,W均为阴性。提示所检测样品,均未发现甲基化。　　 结论：MSP检测未发现异常甲基化存在,非小细胞肺癌中HMGB1表达下调可能是其他原因造成的。　　 第三部分、HMGB1诱导免疫细胞杀伤肺癌细胞的体外实验研究　　 目的：通过体外实验证实HMGBl的抗肿瘤作用。　　 方法：　　 1.分离人外周血中的人树突状细胞,用重组人HMGB1诱导其分化成熟,并检测其表型。　　 2.将成熟的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,观察经诱导的CIK细胞对肺癌A549细胞的毒性作用。　　 结果：　　 1.未成熟DCs培养至第四天,其表型为CD1a为13.7％,CD14为41.9％,CD83为31.28％,HLA-DR为51.11％。HMGB1诱导DCs生长48小时后,CD1a为52.46％,CD14为20.12％,CD83为71.64％,HLA-DR为94.39％,为成熟的DCs表型。HMGBl和TNF-α、A549细胞裂解液一样可以诱导DCs成熟。　　 2.共培养至第14天,各组CIK细胞与第0天相比分别增殖了16.2倍(A549组)、15.6倍(TNF-α组)和13.0倍(HMGB1组),与未加入成熟DCs的CIK细胞组(7.2倍)相比,差异显著(p＜0.05)。各组间无明显差异(p＞0.05)。HMGB1诱导成熟的DCs同TNF-α、A549细胞裂解液诱导成熟的DCs一样可以刺激CIK细胞增殖。　　 3.两个不同效靶比的实验组,均发现DC-CIK细胞对A549细胞的毒性作用要强于单独的CIK细胞,差异显著(*p＜0.05),效靶比高的杀伤活性明显高于效靶比低的(拌p＜0.05)。　　 结论：　　 1.HMGB1可以体外诱导DCs分化成熟。　　 2.成熟的DCs与CIK细胞共培养后较CIK细胞对肺癌A549细胞具有更强的细胞毒作用。