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从被草甘膦极度污染的土壤中分离到一株极端抗草甘膦菌HTG7.它能在900mmol/L草甘膦的限制性培养基Mops上生长.表型及16S rDNA鉴定其为可变盐单胞菌.从可变盐单胞菌HTG7构建的粘粒基因组文库中克隆到一个完整的基因,能恢复EPSP合酶缺陷型菌株E.coli ER2799在限制性培养基中的生长能力,并能在草甘膦浓度为80mmol/L的Mops液体培养基中良好生长.基因全长1350个碱基对,核苷酸序列与目前已报导的编码EPSP合酶的aroA基因几乎没有任何同源性,氨基酸序列与草甘膦抗性相关的美国专利所涉及的22种微生物EPSP合酶的同源性在46﹪以下.利用生物信息学方法,对编码产物进行亚细胞定位,还对其保守结构域、蛋白水解酶的切割位点、蛋白的二级结构、疏水区及跨膜区进行分析预测,所有结果表明我们所克隆的是一个结构新颖、功能明确并高抗草甘膦的新基因.该基因已在GenBank中注册,登录号为AY573186.新基因与pET-28a(+)构建了N-端带有His·Tag和T7·Tag的融合蛋白表达载体,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),30℃能诱导可溶表达.SDS-PAGE显示表达物分子量为51kD;蛋白通过镍离子螯合柱得到了纯化.Western Blot表明经纯化的蛋白可以与检测试剂盒中的抗体特异结合.酶活实验证明表达产物有EPSP合酶的活性.为了寻找EPSP合酶中某些与草甘瞵抗性相关的位点,利用错误倾向PCR技术,对可变盐单胞菌HTG7的EPSP合酶基因进行随机PCR扩增,通过EPSP合酶缺陷型菌株E. coli ER2799的互补筛选,获得了2个不具有草甘膦抗性的EPSP合酶突变体.对突变前后的EPSP合酶进行比较预测,发现突变前后氨基酸位点肽平面和N原子之间形成的扭转角度存在一定的差别.这些结果表明酶的功能主要由中心骨架决定,而肽平面和N原子之间角度的变化,造成高级结构构象细微的差别,致使草甘膦抗性功能的丢失.