研究背景与目的：同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）为非蛋白质组成氨基酸，体内不能合成，其生理作用主要是参与体内一碳单位的代谢，目前公认，体内Hcy浓度升高是导致动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）的独立危险因素之一。因此，对Hcy在As发病机制中所发挥作用的深入研究具有重要的理论和应用价值。而近年来表观遗传学（epigenetics）的飞速发展已逐渐揭示出环境因素对基因表达调控的许多重要机制，染色质和DNA序列的乙酰化和甲基化修饰是近年来受到最广泛关注、并被认为是基因表达的主要epigenetic调控方式。研究表明，Hcy系各种转甲基代谢（包括DNA的甲基化修饰）的甲硫氨酸循环的中间产物，其异常升高可影响DNA的甲基化过程，并进而影响某些基因的表达而促进疾病的发生发展。叶酸（Folic acid，FA）作为一类重要的微营养物质，对维持遗传物质稳定性有重要作用，文献报导叶酸能明显抑制同型半胱氨酸致As作用，而且它可通过Hcy合成甲硫氨酸（Met）和S—腺苷甲硫氨酸（SAM）的生化过程影响DNA的甲基化。5，10—亚甲基四氢叶酸还原酶（5，10-Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是促使Hcy向甲硫氨酸转化的关键酶，也是将叶酸活化为5—甲基四氢叶酸的核心酶。叶酸不足或MTHFR活性降低都将导致Hcy水平升高。由于MTHFR基因启动子区域没有TATA盒，但含有CpG岛和多个潜在的Sp1连接位点，这为MTHFR基因的表达提供了受甲基化调控的结构基础。因此，我们推测，高Hcy也可能反过来干扰代谢Hcy的MTHFR基因启动子区域的甲基化状态，并进而影响其mRNA表达。但这种影响到底产生何种病理生理学效应?尚未见报导。本研究的主要目的是希望通过以临床相关的高Hcy浓度处理人血管平滑肌细胞（human vascular smooth muscle cells，HVSMCs），反作用于代谢Hcy的MTHFR基因，检测高Hcy对其启动子甲基化修饰及其mRNA表达的影响，以了解高Hcy是否通过对MTHFR基因启动子的异常甲基化修饰产生正反馈的损伤效应，即高Hcy→MTHFR基因启动子异常甲基化→MTHFR mRNA表达↓→MTHFR活性↓→Hcy进一步↑，从而促进动脉粥样硬化进行性发展。并同时探讨叶酸可能的干预作用，为As的预防和治疗提供新的思路和启示。材料和方法：本实验人血管平滑肌细胞取自正常脐动脉，采用组织贴块法获得，加入含有20％胎牛血清的DMEM／F12培养液于37℃的CO₂孵育箱内培养，选用3～7代细胞作为实验用细胞。分为对照组：正常生长的平滑肌细胞；Hcy处理组：不同浓度Hcy（0，30，100，200，500，1000μmol／L）分别作用细胞24h，48h，72h；叶酸处理组：100μmol／L Hcy+FA（100μmol／L），500μmol／LHcy+FA（100μmol／L），FA（100μmol／L），作用细胞72h。各组每24h更换一次培养液，并添加新鲜配制的干预液。提取各组细胞基因组DNA，以巢式降落甲基特异性PCR（MS-PCR）分析MTHFR启动子区域甲基化状态。提取各组细胞总RNA，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定MTHFR mRNA的表达水平。数据采用（?）±s表示，应用SPSS13.0软件，采用单因素方差分析方法进行统计学分析，P＜0.05差异有统计学意义。结果：不同浓度和不同时间Hcy干预后，HVSMCs MTHFR基因启动子区域出现去甲基化，甲基化水平明显降低，RT-PCR结果显示MTHFR mRNA表达增加，其mRNA表达水平在100μmol／L Hcy时达到高峰，直至极高浓度Hcy时仍刺激MTHFR mRNA呈高表达，与对照组相比有显著差异。此外，100μmol／L Hcy呈时间依赖关系促VSMCs MTHFR mRNA表达，72h达高峰；而叶酸能明显抑制Hcy所引起的MTHFR基因启动子区域去甲基化，RT-PCR结果显示MTHFR mRNA表达亦有所降低，与Hcy组相比差异有统计学意义，对正常细胞无显著差异。结论：综合上述结果，本文显示，高Hcy可通过引起DNA甲基化修饰的改变，而改变MTHFR基因的表达，叶酸可一定程度的拮抗这种效应。Hcy诱导催化其自身向甲硫氨酸转化的关键酶MTHFR基因DNA去甲基化和mRNA明显高表达，显然有助于降低过高的Hcy，这无疑是一种代偿机制，而非高Hcy的损伤效应；这提示环境因素对基因甲基化修饰的影响可以是损伤的、致病的，但亦可能是代偿性反应。由于干预DNA甲基化修饰的治疗策略已经成为一个重要的研究领域，因此，阐明在同一影响因素下，何以某些基因去甲基化，而另一些基因高甲基化?哪些DNA甲基化修饰的改变是致病的，哪些是代偿性的?对于合理的制定干预策略无疑具有重要的理论和实践意义。