背景自1976年，Friedenstein首次提供了较为直接的证据，证明骨髓中可能存在间质细胞的前体细胞。1984年，Owen首先将这种贴壁生长的骨髓单个核细胞定义为骨髓间充质干细胞（BMSC）。1987年，Friedenstein等又发现，在塑料培养皿中培养的贴壁骨髓单个核细胞在特定的条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，并且扩增20-30代后仍保持其多向分化潜能。而1981年Martin首次从小鼠的胚胎中分离出胚胎干细胞，干细胞移植技术快速发展。2003年,美国FDA率先批准自体骨髓干细胞移植治疗心肌梗死性疾病，随后世界各地均开展了干细胞治疗研究，而应用最为广泛及成熟的是骨髓间充质干细胞，目前我国已经开展了应用骨髓间充质干细胞治疗肝、胰、神经、血管、心脏等器官病变的研究并发表了大量的研究报告而利用骨髓间充质干细胞治疗自身免疫性疾病也已进入临床应用阶段。但不可否认的是：骨髓间充质干细胞虽有一定的治疗效果，但远没有达到人们的期望。尤其许多基础和临床试验相继表明干细胞移植能够修复损伤的心肌，促进血管新生，缩小心肌梗死面积，改善心功能。但不同研究机构对最终骨髓间充质干细胞能在多大程度上改善心功能存有争议。针对此现状，我们认为，可能是由于骨髓间充质干细胞是一群多克隆的细胞群体，不同的克隆亚群具有不同的功能或不同的定向分化方向。能否有效寻找到不同功能的亚群，成为迫在眉睫需要解决的问题。2002年，Daniele Torella等首先从小鼠心脏中分离出一种固有的心肌干细胞，从而打破了人们以往认为心肌细胞属于永生细胞，不可再生的概念。进一步研究发现通过其表面不同的分化抗原，可以分为六个亚群，且六个亚群细胞均可向心肌细胞定向分化。并认为心肌干细胞来源于骨髓干细胞池。在以上研究基础上，我们考虑利用已知的小鼠心肌干细胞的表面分化抗原对小鼠的骨髓间充质干细胞进行筛选，希望能够发现定向向心肌分化的骨髓间充质干细胞克隆亚群。本课题获得苏州大学优秀博士论文及江苏省普通高校研究生科研创新计划资助项目（CXLX12₀841）立项资助。第一部分小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离、培养目的从小鼠骨髓中分离出具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞（BoneMesenchymal Stem Cells，BMSCs）。为进一步细胞分选构建实验平台。方法小鼠全骨髓培养。磁珠及贴壁纯化传代。脂肪、骨及软骨分化实验检测细胞分化功能。流式鉴定细胞表面抗原表达。结果体外培养的原代小鼠骨髓间充质干细胞经7-10天达80%-90%融合。P3代时通过CD11b的磁珠阴选，继续培养至P7。流式鉴定：结果显示超过90％小鼠骨髓间充质干细胞性表达CD29（细胞整合素分子）、CD34（祖细胞表面的分化抗原）和CD44（粘附分子，介导细胞对透明质酸和骨桥蛋白的粘附）；但不表达造血祖细胞表面标志CD11b、MRD-1、ABCG2、CD133。第7代BMSCs中G0／G1期的细胞为73.23％，G2期的细胞为0％，S期（G3）的细胞为0％，细胞处于静止期，符合干细胞特征。结论利用小鼠全骨髓培养。磁珠及贴壁纯化传代。可以有效培养出小鼠骨髓间充质干细胞用于干细胞亚群分选。第二部分小鼠心肌梗死模型的建立目的气管插管开胸直视下行小鼠冠状动脉前降支（LAD）结扎，建立小鼠心肌梗死的模型。方法20只C57BL/6雄性小鼠，体重16-20（17.8±2.2）g，随机分为实验组与对照组（假手术组），各10只。实验组气管插管开胸直视下行小鼠冠状动脉前降支（LAD）结扎。结果结扎后可见肢体导联（I或者aVL）上有Q波出现（〉1mv）。I导和aVL导联上R波的缺失。尤其是II导联可见S-T段明显抬高，超过0.2mv。4周后复查心脏彩超提示：与对照组（假手术组）比较，心梗4周后小鼠左室舒张末期内径（LVEDd）和左室收缩末期内径（LVEDs）明显增加（P<0.01），左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短指数（FS）明显降低（P<0.01，P<0.01），二维图像见心梗模型组左室腔扩大，左室前壁出现节段性运动减弱、消失。病理HE染色证实心梗建模成功。结论气管插管开胸直视下行小鼠冠状动脉前降支（LAD）结扎，可以成功建立小鼠心肌梗死模型。第三部分小鼠骨髓间充质干细胞亚群分选目的将培养完毕的小鼠骨髓间充质干细胞，根据流式结果，采用磁珠分选目的亚群细胞。方法将已培养好的第7代的小鼠骨髓间充质干细胞通过CD45+柱子，分选得到CD45+细胞群体及CD45-细胞群体。将CD45-细胞群体通过CD31+柱子，分选得到SCA-1+/CD45-/CD31-及SCA-1+/CD45-/CD31+两群细胞。再将CD45+细胞群体通过CD31+柱子，分选得到SCA-1+/CD45+/CD31+及SCA-1+/CD45+/CD31-两群细胞。结果最终得到SCA-1+/CD31-/CD45-细胞数量：7.8×106；SCA-1+/CD31+/CD45-细胞数量：3×106；SCA-1+/CD31+/CD45+细胞量：2×105；SCA-1+/CD31-/CD45+细胞量：5×105。磁珠分选的得率约为60%。细胞状态良好，继续培养三周后，各亚群细胞数量可达：2×107。结论磁珠分选对小鼠骨髓间充质干细胞损伤较小，细胞得率尚可，可以满足进一步的研究。第四部分小鼠骨髓间充质干细胞不同亚群向心肌定向分化、抗凋亡、归巢能力的比较目的检测对比小鼠骨髓间充质干细胞不同亚群向心肌定向分化、抗凋亡及归巢的能力。方法首先采用与心肌细胞直接共同培养及5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-氮杂-2’-脱氧胞苷）诱导的方法，检测对比小鼠骨髓间充质干细胞不同亚群体外向心肌定向分化的能力。其次将小鼠骨髓间充质干细胞不同亚群及未分选群放入低氧（5%）、无血清培养环境24小时采用流式检测各亚群及未分选群凋亡率。并采用transwell小室内铺入Matrigel胶检验各亚群及未分选群干细胞体外归巢能力。将小鼠骨髓间充质干细胞4个亚群及一个未分选群体分别注入心梗模型小鼠体内，于48小时、96小时及7天分别行心脏彩超及小动物活体成像比较各亚群细胞体内的差异。结果与心肌细胞共培养和在5-氮杂胞嘧啶核苷诱导下的各亚群小鼠骨髓间充质干细胞均表达出心肌细胞特异性的抗原。荧光定量PCR可知SCA-1+/CD45+/CD31+亚群与心肌细胞共培养表达出心肌细胞特异性抗原、早期心肌启动基因GATA-4、NKx2.5的相对量高于其它亚群。体外采用流式检测各亚群及未分选群干细胞抗凋亡能力可见SCA-1+/CD45+/CD31+抗凋亡能力最强。Transwell小室证实细胞迁移、侵袭能力最强的为SCA-1+/CD45+/CD31+。体内注射干细胞，心脏彩超提示干细胞注射48小时、96小时及7天时SCA-1+/CD45+/CD31+亚群心功能改善明显。小动物活体成像提示：干细胞注射48小时、96小时及7天时：SCA-1+/CD45+/CD31+的亚群平均荧光强度高于其它亚群。采用原位免疫组化检测各亚群干细胞注射96小时心梗心肌，可见局部心肌干细胞大量增加。各亚群细胞动员心肌干细胞的能力为：SCA-1+/CD45+/CD31+>SCA-1+/CD45-/CD31+>SCA-1+/CD45-/CD31->SCA-1+/CD45+/CD31-。结论SCA-1+/CD45+/CD31+亚群体外心肌定向分化、抗凋亡、归巢均优于其它亚群及未分选群。体内实验表明各亚群干细胞注射后首先按照血流动力学完成初次分布，再完成各自归巢。体内实验表明SCA-1+/CD45+/CD31+心功能改善、归巢、抗凋亡能力优于其它亚群及未分选群与体外实验相符。本试验证实小鼠骨髓间充质干细胞各亚群均可以动员心脏干细胞，推测骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死，早期通过旁分泌动员机体自身的心肌干细胞修复。治疗晚期则主要通过干细胞的心肌转分化完成修复。并且各亚群细胞动员心肌干细胞的能力不同。第五部分小鼠骨髓间充质干细胞亚群基因芯片分析目的从分子水平探讨小鼠骨髓间充质干细胞4各亚群生物学表现。方法采用基因芯片技术完成Agilent小鼠全基因4*44K芯片表达谱基因检测。结果在任何两组间存在4倍变化（取对数后的倍数变化值为2），则认为该基因存在差异表达。共有5619个转录本差异表达。对5619个转录本进行GO及Pathway分析后进行聚类分析，可见： SCA-1+/CD45+/CD31+与SCA-1+/CD45+/CD31-、SCA-1+/CD45-/CD31+、SCA-1+/CD45-/CD31-在心血管发育基因上有172个差异表达4倍的基因。SCA-1+/CD45+/CD31+与SCA-1+/CD45+/CD31-、SCA-1+/CD45-/CD31+、SCA-1+/CD45-/CD31-在有关迁移基因上有152个差异表达4倍的基因。SCA-1+/CD45+/CD31-与SCA-1+/CD45+/CD31+、 SCA-1+/CD45-/CD31+、SCA-1+/CD45-/CD31-在有关凋亡基因上有277个差异表达4倍的基因。对涉及的迁移的基因进一步将表达量最高的及最低的基因进行聚类可见：Madcam1、Spag9、Rap2a、I116、Ednrb基因，SCA-1+/CD45+/CD31+较其它组表达明显降低。Ednrb、Dcx、Rasgrf1、Srgap1基因，SCA-1+/CD45+/CD31+较其它组表达明显增高。对涉及的有关心血管发育的基因进一步将表达量最高的及最低的基因进行聚类可见：Rapgef1、Dsc2、Nrcam、Pr17d1、Itga4、Pcsk5、Scma3c、My13、Myo18b、Chi31l基因，SCA-1+/CD45+/CD31+较其它组表达明显升高。Nrcam、Co111a1、Prrx1基因，SCA-1+/CD45+/CD31+较其它组表达明显降低。对涉及的有关凋亡的基因进一步将表达量最高的及最低的基因进行聚类可见：Park2、Prkcb、Frzb、Dmpk基因，SCA-1+/CD45+/CD31+较其它组表达明显降低。Lcn2、Egr3、Pik3r3、Mdrn4、Cul7、Fcerlg、Map3kg基因，SCA-1+/CD45+/CD31+较其它组表达明显增高。将SCA-1+/CD45+/CD31+与其它组的迁移基因的聚类分析及Network结果共同比较可见Dcx及MADCAM1为两者的交集说明其功能及表达量与其它亚群不同应为有关迁移的关键基因。将SCA-1+/CD45+/CD31+与其它组的心血管发育基因的聚类分析及Network结果共同比较可见两者无交集，考虑上述差异基因均为4倍表达，固以Network结果为主可见：SETD2、NCL、EPOR、Rock2为感兴趣基因。将SCA-1+/CD45+/CD31+与其它组的有关于凋亡基因的聚类分析及Network结果共同比较可见两者无交集，考虑上述差异基因均为4倍表达，固以Network结果为主可见：NFkB1、RB1、E2F1为感兴趣基因。结论进一步明确小鼠骨髓间充质干细胞为一多克隆的群体。通过基因芯片结果可知在表达调节循环系统发育基因上主要是由于SETD2、NCL、EPOR、Rock2的作用导致SCA-1+/CD45+/CD31+亚群细胞与其它三组细胞存在有明显差异。在表达调节细胞迁移基因上主要是由于Dcx及MADCAM1作用导致SCA-1+/CD45+/CD31+亚群细胞与其它三组细胞存在有差异。在表达调节细胞凋亡基因上主要是由于NFkB1、RB1、E2F1的存在导致SCA-1+/CD45+/CD31+细胞与其它三组细胞在抗凋亡上存在有明显差异。