论文部分内容阅读
目的探讨仿生电刺激对离体心肌微环境诱导胚胎干细胞(ESCs)向心肌样细胞分化的作用,为建立一套简单实用的胚胎干细胞移植技术提供理论依据。方法分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,以DAPI(4’6-联眯-2-苯基吲哚)染核作为细胞标记。收集昆明小鼠3.5d和4d胚龄的胚胎,以鼠间充质干细胞为饲养层,4～5d后取隆起生长的内细胞团分离后再培养,观察集落的生长情况并通过碱性磷酸酶染色、OCT-4染色等对细胞集落进行鉴定。然后取3～4代ESCs,按是否给予胚胎干细胞仿生电刺激及心肌微环境诱导分为对照组、电刺激组、心肌组、电刺激+心肌细胞条件培养液组、电刺激+心肌组,每组又以实验干预培养时间(5、7、14天)分为3个亚组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)。分别于实验的5、7、14天观察各组细胞生长情况,行肌钙蛋白T(cTnT)免疫荧光染色检测。结果(1)以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养的昆明小鼠胚胎干细胞(ESCs)有其典型的形态学特征,对ESCs碱性磷酸酶进行检测,ES细胞显微镜下为棕褐色;Oct-4染色阳性。(2)电刺激组及对照组培养体系中始终未出现节律搏动的心肌样细胞,分化的细胞cTnT蛋白荧光染色均阴性;(3)心肌组、电刺激+心肌细胞条件培养液组、电刺激+心肌组均约7天左右出现节律搏动的心肌样细胞,观察至14天时,搏动频率约为30～50次/min。(4)电刺激+心肌细胞组和肌细胞、电刺激+心肌细胞条件培养液组相比,电刺激心肌细胞组中心肌细胞长势更好,ESCs分化而来的心肌样细胞搏动更快,更趋于一致性,记录已搏动和未搏动ESCs诱导分化后的心肌样细胞cTnT蛋白荧光染色阳性率更高,约为40%,显著高于心肌细胞组(28.7%)、电刺激+心肌细胞条件培养液组(17.1%)(P<0.05)。结论(1)以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞可行,得到的胚胎干细胞能保持特殊的形态和未分化状态。(2)未经建系操作的ESCs可被诱导分化为节律搏动的心肌样细胞;成熟心肌细胞与ESCs共培养状态下,成熟心肌细胞可诱导ESCs向心肌细胞分化,这种微环境下ESCs向心肌细胞定向分化率显著高于自然分化组,即成熟心肌细胞是诱导ESCs定向分化中较强的诱导因素。(3)单独仿生电刺激因素还不足以诱导胚胎干细胞向心肌细胞定向分化。(4)仿生电刺激可促进心肌微环境诱导胚胎干细胞向心肌样细胞分化,提高胚胎干细胞定向分化为心肌样细胞的分化率,但是不能使胚胎干细胞向心肌样细胞分化的时间点提前。