植物乳杆菌LPC-1胞外多糖发酵、结构解析及诱导水稻抗逆性研究

来源 :江西农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:gyzviking
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乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的由单糖及衍生物组成的糖类高聚物,由于其良好的理化性质和生物活性,广泛应用在食品、医药行业。目前一些研究表明,不同来源的多糖在促进植物生长、提高植物抗逆性方面均有良好的功效,其中,乳酸菌作为一种安全的食品级微生物,其胞外多糖也被认为是安全无毒的,因此其胞外多糖在农业领域的开发与应用具有广阔的应用前景和研究价值。本论文以筛选高产胞外多糖乳酸菌出发,对其胞外多糖的发酵、提取优化、结构解析、诱导水稻抗逆性等方面进行了研究,主要结果如下:(1)采用菌落拉丝法与多糖产量相结合的方法筛选得到一株高产胞外多糖的乳酸菌LPC-1,通过形态学观察、生理生化鉴定、分子生物学的手段鉴定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。以L.plantarum LPC-1胞外多糖产量为指标,通过单因素优化得到结果分别为:最佳碳源为蔗糖,蔗糖30 g·L-1,最佳氮源为大豆蛋白胨,大豆蛋白胨10 g·L-1,发酵时间24 h、温度30℃、初始pH 6.5、接种量4%。利用Plackett-Burman试验设计筛选出影响L.plantarum LPC-1合成胞外多糖的3个显著因子,分别为温度、pH、柠檬酸氢二铵浓度。采用中心组合设计及响应面分析,得到最优发酵工艺条件为:温度32℃、pH 6.7、柠檬酸氢二铵3 g·L-1,在此条件下发酵测得实际产量为2064.69 mg·L-1,与预测值基本吻合,与优化前相比增加了48.64%。(2)通过比较了Sevage法和三氯乙酸(TCA)法脱除蛋白的效果,终浓度为4%的三氯乙酸脱除蛋白效果较好,蛋白脱除率可达到80.62%。通过单因素和Box-Behnken试验设计进行优化胞外多糖提取工艺条件,分析并修正后得到最佳胞外多糖提取工艺条件为乙醇浓度96%,醇沉时间12 h,醇沉温度6℃,以此条件进行验证试验,可以得到胞外多糖平均提取量为2147.25 mg·L-1。(3)经脱蛋白、透析后的L.plantarum LPC-1胞外多糖依次使用DEAE-Cellulose-52和Sephadex G-100柱层析进行分离纯化后主要的到两个组分(EPS-1和EPS-2)。采用多种方法对两个组分进行结构解析,结果发现,使用扫描电镜观察发现,两个组分的多糖的表面形貌存在一定的差异性,EPS-1表面光滑且聚集紧密,并有较大的孔洞,而EPS-2表面光滑且排列松散,孔洞较小;采用紫外全波长扫描发现,EPS-1含有少量的核酸和蛋白质,而EPS-2基本不含有核酸和蛋白质;采用红外光谱分析表明,EPS-1和EPS-2均具有多糖的典型特征吸收峰,均存在吡喃糖构型,EPS-1同时具有α糖苷键和β糖苷键,而EPS-2只含有β糖苷键;采用糖腈乙酰酯衍生化法及气相色谱法对多糖样品的单糖组成进行分析,结果表明,EPS-1的单糖组成及摩尔比为甘露糖:葡萄糖为2.40:15.01,EPS-2的单糖组成及摩尔比为甘露糖:葡萄糖为3.02:11.63。通过体外抗氧化活性研究表明,EPS-1和EPS-2均具有一定的抗氧化能力,尤其表现在对DPPH自由基的清除能力,在浓度为8 mg·mL-1以上时,EPS-1的清除能力可以超过VC。(4)通过利用乳酸菌胞外多糖浸种发现,乳酸菌胞外多糖浸种对水稻种子的发芽率和发芽势并没有显著的影响,但能显著增加水稻萌发的根长,同时对种子内可溶性蛋白含量及淀粉酶活力也有显著影响。将不同浓度乳酸菌胞外多糖施加于土壤,同时以相同浓度的葡萄糖作为对照,结果表明,在土壤中添加不同浓度的乳酸菌胞外多糖能促进水稻幼苗的生长,提高土壤酶活性,同时对土壤养分也有明显的改善效果。相关性分析表明,外源物质介导的土壤环境因子变化与水稻的生长作用关联极为密切。主成分分析结果证明,乳酸菌胞外多糖对水稻生长及土壤环境因子的作用效果与葡萄糖存在明显区别。(5)采用室内恒温培养试验,研究不同浓度乳酸菌胞外多糖对水稻种子萌发及相关生理代谢指标的影响。结果表明,采用不同浓度胞外多糖浸种可以显著提高逆境胁迫下水稻种子的发芽势、发芽率及发芽指数,促进水稻根系生长,随着胞外多糖浓度的升高,对水稻种子萌发的促进作用呈先升高后降低趋势;胞外多糖浓度为200mg·L-1时,缓解逆境胁迫伤害效果最为显著:pH值为3.0的酸胁迫下,与不添加胞外多糖相比,水稻种子的发芽势、发芽率及发芽指数分别提高了178.2%、38.7%和114.4%;7 mg·mL-1NaCl胁迫下,发芽势、发芽率、发芽指数分别提高了152.9%、73.8%、103.0%,且差异均达显著水平(p<0.05);胞外多糖浸种可显著降低各胁迫下水稻幼芽丙二醛(MDA)含量,不同程度地提高过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶活性,可缓解逆境胁迫对水稻造成的毒害,为微生物源物增强作物抗逆性研究提供了理论依据。(6)通过外源添加乳酸菌胞外多糖至铜胁迫下的土壤中,研究其对水稻幼苗的生长及根际土壤环境的影响,结果表明,外源添加不同浓度乳酸菌胞外多糖对铜胁迫下水稻幼苗的生长指标和土壤环境有显著的改善,当添加胞外多糖含量为2 g·Kg-1且幼苗长至第10天时,缓解效果最好,高浓度铜胁迫时,与相同胁迫不添加多糖相比,其株高、叶长、叶宽、根长、根数、鲜重分别增加了34.28%、44.66%、22.22%、41.81%、21.43%、46.15%。第20天时,高浓度铜胁迫下外源添加乳酸菌胞外多糖浓度为2 g·Kg-1时,与不添加多糖相比,其中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及总叶绿素含量分别提高了61.01%、45.11%、211.72%、58.06%。同时铜胁迫下添加胞外多糖可以显著提高可溶性糖和蛋白含量,以及抗氧化酶活性,降低MDA含量和质膜透性。另外一方面,对于土壤理化性质和土壤酶活也有一定程度的提高,利用实时荧光定量PCR技术研究发现,低浓度铜胁迫下添加胞外多糖对Sulphate transporter、CatA、OsHMA4、Cytochrome P450基因表达有一定的促进作用。
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