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胆碱单加氧酶(CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是合成甜菜碱的两个关键酶。甜菜碱是一种小分子、非毒性的渗透调节物质,在植物耐盐中起着重要的作用。我们实验室的前期工作发现辽宁碱蓬CMO基因启动子(pC:-267~+1bp)和BADH基因启动子(pB:-300~+1bp)是盐诱导表达启动子,400mmol/L NaCl诱导时,其驱动的GUS活性分别是未经NaCl诱导时的5倍和6.3倍。这两个启动子中除具有基本组成元件外,还包括盐诱导表达元件GT-1 cis-element(GAAAAA)等多个胁迫诱导元件。
AtGT-3b转录因子是拟南芥中的一个受NaCl和病原体诱导表达的GT-1-like转录因子,它能与GT-1 cis-element(GAAAA)相互作用,促进下游基因的表达。CMO基因启动子和BADH基因启动子序列上均含有AtGT-3b转录因子的识别位点GAAAAA。本文对AtGT-3b转录因子与CMO、BADH基因启动子中GT-1cis-element(GAAAAA)之间的相互作用进行研究,分析CMO、BADH的转录调控机制。
本文克隆了拟南芥AtGT-3b基因,并将该基因转入已含有pC、pB的转基因烟草(C5A、B5A)中。对获得的转AtGT-3b转录因子的转基因烟草的基因表达和GUS表达活性等进行了分析。主要结果如下:
1、用RT-PCR技术获得拟南芥AtGT-3b基因编码区,该编码区长870bp,编码一个由289个氨基酸组成的多肽。构建了克隆载体pMD19T-AtGT-3b,并通过冻融法导入大肠杆菌DH5a,得到了E.coli-pMD19T-AtGT-3b。
2、构建了植物表达载体pB1121-AtGT-3b,冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,获得工程菌LBA4404-pB1121-AtGT-3b。
3、农杆菌介导的叶盘转化法将AtGT-3b基因导入C5A、B5A烟草,获得具有卡那霉素抗性的转双价基因烟草,PCR检测获得阳性植株;RT-PCR检测表明,AtGT-3b基因已在转基因烟草中表达;GUS组织化学分析和GUS荧光定量分析表明,转双价基因烟草的GUS活性有所增高,说明AtGT-3b转录因子能够与CMO、BADH基因启动子相互作用,促进了下游基因的表达。