研究背景:严重创伤是一个危害公共健康的世界性难题,已成为世界第四大常见死亡原因。严重创伤患者在伤后往往并发脓毒症和多器官衰竭等严重并发症,并导致最终死亡。对人类健康和社会经济发展已构成巨大的负面影响,因而是目前全球范围内危重病医学领域内亟待解决的重大科学问题。虽然目前脓毒症的治疗方法众多,但是脓毒症的治疗水平并无明显的提高。脓毒症虽然不是遗传病,但是感染引发的炎症反应是以机体内众多基因的表达变化为基础的。脓毒症表型和预后的差异在很低程度上取决于炎症反应的程度。现已研究表明,基因组上的变异,即基因多态性是造成个体间感染反应差异性的重要物质基础。因此,从基因背景上深化研究感染引发炎症反应的发生规律及其与脓毒症风险性和预后的关系,不仅为进一步揭示脓毒症的发病机制提供新的理论认识,更重要的是,这些新的研究技术将有可能从遗传背景上准确判断病人并发脓毒症的风险性和预后,为脓毒症病人个体化治疗提供科学依据,同时基于功能性基因突变可研制出更有针对性的新的治疗方法,甚至有可能开创脓毒症基因治疗的新纪元。白细胞介素-10是T细胞辅助产生的以抑制Th1细胞克隆的细胞因子合成为特点的多效免疫调节因子。近年来白细胞介素-10在创伤后并发症发生发展过程的作用日益受到重视,一般认为严重创伤后机体白细胞介素-10合成和释放水平显著增加,与机体创伤后发生免疫功能麻痹有非常密切的关系。宿主免疫细胞表面模式识别受体是免疫系统感知病原菌入侵以及病原菌引起免疫反应的首要环节。脂多糖结合蛋白和髓样分化蛋白2是很重要的模式识别受体分子。脂多糖结合蛋白不仅在脂多糖的识别和革兰氏阴性菌感染中有重要作用,在革兰氏阳性菌的感染中也有重要作用。MD-2能通过改变TLR4胞外区的构型而增强其对LPS的亲和力。高迁移率蛋白-1和其配体-糖基化终产物受体也是脓毒症发生过程中的重要分子。基于此,这些创伤后脓毒症和多器官功能不全发生重要的重要基因的标签单核苷酸多态性被作为研究对象,进行基因分型,统计学关联分析以及后续的体内体外功能研究和临床关联研究。材料与方法:1.样本。本研究收集了重庆和浙江两个地区的严重创伤患者DNA样本。所有采集的样本均为居住在中国的汉族人,相互间无血缘关系。重庆地区的样本来自于2005年1月至2010年7月重庆市大坪医院创伤中心和重庆市急救中心收集的患者血样;浙江地区的样本来自于2007年1月至2010年7月浙江大学第二附属医院创伤与急救中心收集的患者血样。患者纳入标准为:（1）创伤后24小时内;（2）ISS评分≥16分;（3）年龄≥18岁且≤65岁,性别不限;（4）存活时间超过1周。2.标签单核苷酸多态性的筛选。LBP, HMGB1, RGAE和MD-2基因的转录起始位点上游3-10kb至其终止子下游3-10kb范围及基因所有内含子和外显子范围内进行标签单核苷酸多态性的筛选。基因分型资料来源于人类单体型图计划（HapMap,www.hapmap.org）的45例中国北京汉族人群。用Haploview软件构建基因的单倍域,其标准是,若一段区域内95%以上的SNP之间D’值的95%可信区间上限大于0.98,下限大于0.7,则说明该区域在遗传上几乎没有发生重组,该组SNP构成一个单倍域。利用Tagger软件在单倍域内进行标签单核苷酸多态性的筛选。3.基因分型。采用焦磷酸测序法对LBP,HMGB1,MD-2和RAGE基因进行标签SNPs的分型。焦磷酸测序法是一个基于测序的可靠的SNP分型方法,按照仪器说明反应在28°C进行,仪器根据每个碱基的峰高进行结果的自动判读。采用RFLP-PCR对白细胞介素-10基因进行分型。基因分型结果均通过随机抽取10%进行第二次分型确认。4.细胞因子表达水平检测:取严重创伤患者入院后第一天全血,37°C,100ng/ml LPS刺激4小时后,离心收集血浆。用ELISA方法检测血浆细胞因子表达水平,方法参照试剂盒说明书。5.蛋白分子模建。杀菌性/通透性增加蛋白（BPI）与LBP蛋白有高度的同源性,以已知晶体结构的BPI结构为模板,对LBP进行晶体结构模建。通过几何距离测量的方法,对氨基酸之间的距离,疏水口袋的面积和体积进行了分析。用Discover₃模块对范德华力进行计算。6.获取重组人野生和突变LBP蛋白。以肝组织RNA反转录的cDNA为模板,用PCR的扩增的方法获得人LBP基因的cDNA全长片段。将之插入pCI-neo质粒的EcoRI site和XbaI位点之间。用位点特异的点突变的方法获得26877T→C突变。重组质粒送公司进行测序。用野生和突变两个质粒转染CHO细胞,收集转染后24小时的上清进行人LBP ELISA检测,以确定LBP的表达水平。7.rs2232618对LPS结合及转运的影响。将Raw264.7细胞的上清更换为无血清培养基后,用200ng/ml的野生和突变LBP蛋白,100ng/ml LPS或FITC-LPS进行刺激,收集上清进行TNF-αELISA检测。PBS清洗细胞后,进行荧光强度检测。8. rs2232618对LBP与CD14结合的影响。用ELISA的方法来检测重组LBP蛋白与CD14的结合力。在酶标板上包被10μg/ml CD14蛋白。PBS清洗5遍后,用100ng/ml LPS与重组野生及突变LBP蛋白混合加入包被的孔中,37°C反应1小时。用山羊抗人LBP一抗及辣根过氧化物酶标记的抗山羊的二抗来检测与CD14结合的LBP的量。酶标仪检测每孔的OD值。9. rs1800625 （-429T/C）对RAGE基因启动子活性的影响。为进一步明确-429T/C对RAGE启动子活性的影响,用PCR方法以野生型DNA样本为模版,扩增RAGE启动子-597～+26bp片段,构建pGL3BH-TT质粒。通过定点突变,构建pGL3BH-CC质粒。将两种质粒转染U-937细胞系,通过化学发光检测仪观察碱基改变对启动子活性的影响。10.临床关联研究:脓毒症诊断标准:（1）有病原菌培养证据;（2）体温高于38.5℃或低于36.5℃;（3）白细胞计数高于10×109/L或低于4×109/L。根据患者呼吸功能（氧合指数）、肾功能（血浆肌酐浓度）、肝功能（血浆胆红素浓度）、心血管功能（血压调整后心率）、凝血功能（血小板计数）和中枢神经系统（格拉斯哥评分）等变化计数器官功能障碍评分。创伤ISS评分采用简明损伤定级标准（1998版）。11.统计分析:各SNP的等位基因型频率由基因计数获得。H-W平衡采用卡方检验计算。组间荧光素酶活性通过单因素方差分析比较。多态性与MODS评分、细胞因子表达水平间的关系采用单因素方差方法统计。等位计量效应采用线性回归分析统计,并用年龄、性别及ISS评分校正。显性及隐性遗传模式下各基因型与脓毒症发生率之间的关系采用卡方检验方法统计。等位计量效应采用多重Logister回归分析计算,并对年龄、性别及ISS评分校正。检验效能通过在线软件Power and Sample Size Program software （http://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize）计算。结果:1. IL-10的-1082位点与脓毒症的发生密切相关,A等位基因携带者患创伤后脓毒症和MODs的几率明显增高。-1082A,-592A等位基因和ATA单体型与低血浆IL-10水平有关;2.通过对重庆和浙江人群统计学关联分析,我们发现LBP rs2232618 C等位基因携带者患创伤后脓毒症及MODs的几率显著高于T等位基因携带者。LBP蛋白第436位氨基酸是高度保守的,其由苯丙氨酸被亮氨酸替代以后可能导致LBP蛋白的C端活性中心的结构改变,突变后范德华能减小,导致分子构型稳定性减低,从而使疏水口袋变大,可能更容易与CD14结合。转染CHO细胞获得野生和突变两个蛋白,用重组蛋白进行LPS结合和刺激实验表明,突变蛋白刺激巨噬细胞后,细胞分泌TNF-α的水平显著高于野生蛋白,且转运LPS的能力也显著高于野生蛋白。我们用ELISA的方法直接检测两个重组蛋白与CD14蛋白的结合力大小的实验显示,突变蛋白与CD14结合能力明显高于野生蛋白（P=0.043）。这表明,rs2232618多态性可能通过影响LBP蛋白C端活性中心的结构从而影响了LBP蛋白与下游CD14分子的结合能力,突变LBP蛋白更易与CD14分子结合,使其传递LPS的能力增强,更易于激发炎症反应。因此我们推断,rs2232618不仅是一个影响LBP蛋白功能的重要多态性位点,也是一个预警创伤后并发症的分子标记。3.在HMGB1的3个标签SNPs中,只有rs2249825与LPS刺激血浆后HMGB1水平相关。rs2249825是一个位于内含子1的C→G突变,会改变v-Myb转录因子的结合,v-Myb是一个HMGB1表达的强的增强子（1）。与此一致的是,rs2249825与创伤后脓毒症和MODs发生密切相关。而另外2个标签SNPs（rs1412125和rs1045411）不影响患者创伤后的并发症发生率。4.通过对重庆和浙江两个地区创伤人群的关联分析,MD-2的3个标签SNPs中,只有rs11465996与创伤后脓毒症和MODs的发生均密切相关。该结果与实验室前期实验结果一致（2）,我们前期已证实,-1625C/G（rs11465996）是一个影响MD-2启动子活性的有功能的位点。5.RGAE基因rs1800625（-429T/C）是一个与创伤后脓毒症和MODs发生密切相关的位点,T等位基因携带者有更高的患病率。荧光报告基因实验证实,-429C会减弱RAGE启动子活性。结论:IL-10基因的-1082A/G,LPB基因的rs2232618,HMGB1基因的rs2249825,MD-2基因的rs11462996及RAGE基因的rs1800625都是与创伤后脓毒症和MODS发生密切相关的多态性位点。LBP基因的rs2232618（Phe436Leu）是一个影响LBP蛋白结构从而影响LBP与CD14分子结合的多态性位点。RAGE基因的-429的T→C的突变会减弱RAGE启动子的活性,也是一个功能性位点。这些与脓毒症和MODs发生密切相关的SNPs位点可以作为疾病预警中的分子标志,对于早发现,早治疗疾病有重要作用。