论文部分内容阅读
研究背景颅内动脉粥样硬化性狭窄(intracranial atherosclerotic stenosis,ICAS)是全球脑缺血性卒中的主要病因之一,是我国脑缺血性卒中的首要病因。大量研究已证实侧枝循环和卒中的发生和预后密切相关,但大约70%左右的中重度ICAS患者不存在侧枝循环(60%)或存在极少量侧枝循环(10%)。症状性颅内动脉粥样硬化性狭窄患者(symptomatic ICAS,sICAS)1年内卒中再发率和死亡率高达15%。对于这部分患者,目前主张的治疗方案是以抗血小板为主,血管危险因素控制为辅的内科治疗。尽管近十年因强化药物治疗方案(intensive medical management,IMM)的优化和对疾病认识的加深,sICAS的预后有所改善,但其1年内卒中再发率和死亡率仍维持在10%以上,而对于这部分患者因不响应IMM而导致卒中再发的病理生理机制仍不明确。随着新型血液分子标志物的发现以及相应检测技术的提升,疾病的血清学研究再度成为热点。探索sICAS的血液分子标志物不仅可以作为量化疾病转归的标尺,也有利于揭示疾病进展的相关机制,开发新型的治疗靶点。研究目的(1)探索和验证血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)选择性剪切产物,即a,b亚型的血清表达水平与ICAS患者侧枝循环建立的相关性(2)探究与sICAS IMM不响应,缺血事件再发相关的血液细胞因子;(3)探究与sICAS IMM不响应,缺血事件再发相关的血液外泌体微小核糖核苷酸(exosomal microRNAs,e-miRNAs),软件分析结局相关e-miRNAs的生物功能以及对(2)中结局相关细胞因子的调控,并提出sICAS疾病进展的病理机制。研究方法本队列研究招募sICAS患者,通过血管造影明确患者存在重度ICAS(>70%狭窄)且对侧枝循环状态进行评估。对入组后的患者即刻采血,离心后取血浆,超低温冷藏备用,用作血液分子标志物的测定。第一部分同时招募烟雾病(moyamoya disease,MMD)患者和癫痫患者分别作为阳性对照和阴性对照,同样在入组后即刻采血。应用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测量和比较三组患者VEGF-A165a、b亚型的含量和比值;第二部分通过对入组的sICAS患者进行1,3和6个月的随访,评估患者IMM治疗的依从性并判断是否存在的缺血事件的发生,并根据6个月内有无再发缺血事件分为两组,即IMM响应组(Responders)和IMM不响应组(Non-responders)。应用ELISA测量和比较两组患者的13种促血管生成细胞因子和8种抗血管生成细胞因子的血浆浓度,通过主成份分析筛选与结局显著相关的细胞因子;第三部分通过倾向值匹配法将Responders和Non-responders两组的患者进行年龄、性别和IMM依从性的匹配,运用第二代测序构建匹配后患者e-miRNAs的测序数据库。在对测序数据进行降噪和标准化处理后,用主成份分析筛选与结局显著相关的e-miRNAs。通过 Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件分析结局相关 e-miRNAs的生物功能和对(2)中结局相关细胞因子的调控。研究结果研究共纳入了 74名重度sICAD患者,其中29位在6个月随访中再发缺血性事件。第一部分从74名患者中选择了美国介入和治疗性神经影像协会/介入放射学协会侧枝循环评分系统分级2级以下的ICAS患者,共计66位,并纳入了 6名MMD患者和5名癫痫患者。ELISA显示MMD患者的总VEGF-A165血浆水平与sICAS和癫痫患者无显著差异,但VEGF-A 165a/b显著高于sICAS组(p=0.015)和癫痫组(p=0.043)。第二部分74名重度sICAD患者在6个月随访期间有3位患者再发短暂性脑缺血发作,17位患者再发缺血性脑卒中,9名患者再发短暂性脑缺血发作和缺血性脑卒中。主成分分析将包含21个细胞因子的数据转化成了 7个向量,其中多因素逻辑回归显示只有向量4和缺血性事件再发的结局显著相关(p=0.02),临床变量纠正后仍具有显著性(p=0.003)。向量4中的主要组分为可溶性血管内皮生长因子受体 1(soluble vascular endothelial growth factor 1,sVEGFR1)、endostatin、血管抑素(angiostatin)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和VEGF-A165a,向量整体表现为抑制血管生成。第三部分倾向值匹配法将11位Responders和11位Non-responders进行两两配对。主成分分析将122种血清中分离的e-miRNAs转化为13个向量,其中只有向量3和结局显著相关(p=0.0052)。在向量3中,13个绝对系数为前25%的e-miRNAs构成的新向量3和原向量3呈显著相关(R2=0.940),且在结局的预测上具有90%的灵敏度和 100%的特异度。这些 e-miRNA 包括 miR-27b-3p,miR-122-5p,miR-16-5p,miR-30c-5p,miR-486-5p,miR-10a-5p,miR-10b-5p,miR-101-3p,miR-24-3p,miR-192-5p,miR-30c-5p,miR-425-5p 和 miR-191-5p。IPA 分析显示,这 13 个 e-miRNAs中的7个e-miRNAs和血管生成有关的生物功能显著相关(p<0.025),5个为上述结局相关细胞因子的上游调控分子。Non-responders样本中的e-miRNAs的特异表达谱提示对血管生成的抑制作用,且对上述细胞因子表达的调控和实际观察的表达情况完全相符。结论由血液分子标志物表达水平提示的抑血管生成的表型可能与sICAS患者侧枝循环发育不良和不响应IMM相关,预示sICAS的疾病的不良预后。