腺病毒(Adenovirus, Ad)载体广泛应用于基因治疗和重组疫苗研究,归其原因有以下几点：外源基因克隆操作简易；病毒生产纯化方便；目的基因转移效率高；安全性好(病毒基因组不整合到宿主染色体)。目前使用的腺病毒载体主要来源于C组Ad2或Ad5,使用整合并表达Ad5E1区基因的293细胞包装重组病毒。人腺病毒分为A-G共7个种,含有50多个型,它们的靶器官各不相同。将不同型的腺病毒开发为基因转移载体,一方面有利于充分利用腺病毒的靶向性(提高对目标器官的基因转移效率,减少病毒使用剂量,增强安全性)；另一方面,有利于逃避机体对同一病毒产生的免疫力(增加了基因治疗过程中重复给药的机会)。但是293细胞并不能用于包装各种E1区缺失的重组病毒,即293细胞表达的Ad5E1区基因产物并不能完全互补其他腺病毒E1区的功能,分子机理不明,这使得在构建各型腺病毒载体系统时,还需要另外构建特定的包装细胞系。Ad41属于腺病毒F组(种),能引起婴幼儿腹泻,又称腹泻腺病毒或肠道腺病毒,具有开发为肠道靶向基因转移载体的潜力。由于体外培养困难,所以F组腺病毒也被称为难养腺病毒。2008年,我们将Ad41的早期基因E1855K稳定转染至293细胞中,筛选出一株293E12细胞,这株细胞可以用来培养野生型Ad4l或E1区缺失的重组Ad41。293E12初步解决了Ad41难以培养的问题,但其重组病毒扩增效率不高。2010年,我们通过引入Ad41三联体前导序列(Tripartite leader, TPL)构建了真核表达载体pcDNA3-TPL-E1B55K,将其转染至293细胞筛选得到293TE7细胞,该细胞株相比于293E12细胞可以表达更高水平的Ad41E1B55K蛋白,我们将293TE7用于重组Ad41的拯救和扩增。本论文的第一部分将从病毒基因组扩增效率,病毒晚期蛋白表达水平等方面对新构建的293TE7细胞进行病毒包装能力的评价。腺病毒E1855K蛋白主要是通过与另一个早期蛋白E4orf6相互作用形成E3泛素连接酶复合物而发挥功能,包括泛素化p53, Mre11, DNA ligase IV, Integrin α3等底物并使其经蛋白酶体途径降解。Ad41难以在293细胞中培养,但在表达Ad41E1B55K蛋白的293E12细胞及293TE7细胞中增殖旺盛,我们推测原因可能是293细胞中的Ad5E1B55K蛋白无法替代Ad41E1B55K的功能。论文第二部分试图通过研究Ad5和Ad41E1B55K和E4orf6蛋白的相互作用,揭示293TE7细胞能够有效包装重组Ad41的分子机理。本研究将为其他型腺病毒载体系统(包括腺病毒质粒和包装细胞系)的构建提供理论指导。一、293TE7细胞包装能力评价293E12及293TE7均整合表达Ad41E1B55K基因,而293TE7中的表达水平较高。本部分主要对Ad41GFP病毒(E1区缺失并携带GFP报告基因的重组病毒)在293,293E12及293TE7细胞中的扩增效率进行了比较,并对Ad41GFP在293TE7细胞中增殖时病毒基因组稳定性及其高效复制的原因进行了分析。将Ad41GFP以不同感染复数(multiplicity of infection, MOI)感染细胞,于不同时间点回收子代病毒并进行病毒滴度测定,结果显示293TE7细胞包装产生的子代病毒量是293E12细胞的3-20倍,是293细胞的20到500倍。例如：使用Ad41GFP以12vp/cell (viral particle per cell)感染细胞,感染6d后,293TE7细胞中产生的子代病毒量是293E12细胞的17倍,是293细胞的240倍。这表明相比于293E12细胞,293TE7细胞的重组病毒包装能力明显增强。通过比较病毒基因组复制和晚期蛋白表达水平,我们分析了重组病毒在293TE7细胞复制水平较高的直接原因。等量Ad41GFP感染后,real time PCR结果表明293TE7细胞合成的病毒基因组是293E12细胞的1.5-1.7倍;Western blot结果显示293TE7细胞合成更多的病毒晚期蛋白(Protein V和fiber)。Ad41GFP在293TE7细胞中传代5次后,经Hirt法提取的病毒基因组使用限制性内切酶进行酶切分析,结果显示病毒基因组稳定。以上结果显示293TE7细胞的构建较好地解决了重组Ad41的培养问题。二、E1855K与E4orf6蛋白之间相互作用的研究新近研究表明,早期病毒蛋白E1B55K与E4orf6蛋白通过相互作用形成E3泛素连接酶复合体来行使其主要功能。本部分观察Ad5和Ad41两种型别的E1B55K与E4orf6能否相互作用形成E3泛素连接酶复合物,并进一步检测E1B55K与E4orf6相互作用对细胞内E3泛素连接酶复合体的底物p53、Mre11蛋白水平的影响。为了便于目的蛋白的检测,我们在E1B55K蛋白N端添加HA标签,在E4orf6蛋白N端添加Flag标签。1.质粒构建。首先通过PCR方法分别扩增携带HA标签的Ad5与Ad41的E1B55K基因,然后将其克隆至pcDNA3载体,得p5HAE1B与p41HAE1B质粒；同时,通过PCR方法分别扩增携带Flag标签的Ad5与Ad41的E4orf6基因并将其克隆至pcDNA3载体(为了防止E4orf6在表达过程中发生选择性剪接,在引物设计时对发生选择性剪接的位点进行了碱基突变),得p5FlagE4及pcDNA3-SP41FE4N2表达载体。表达载体经测序验证后转染H1299细胞,间接免疫荧光及western blot方法检测到目的蛋白的表达。2. E1B55K和E4orf6蛋白相互作用及对相关细胞蛋白的降解。通过共转染Ad5E4orf6和Ad5E1B55K或Ad41E1B55K至H1299细胞,收获细胞总蛋白进行免疫共沉淀实验,western blot结果显示,Ad5E4orf6蛋白既能与Ad5E1B55K蛋白相互作用、也能与Ad41E1B55K蛋白相互作用形成E3泛素连接酶复合物。Ad5E4orf6与Ad5E1B55K蛋白相互作用后能够促使细胞内的p53蛋白及Mre11蛋白降解,而与Ad41E1B55K蛋白虽然能够相互作用,但却无法降解p53及Mre11。共转染Ad41E4orf6和Ad5E1B55K或Ad41E1B55K至H1299细胞,收获细胞总蛋白进行免疫共沉淀实验,结果显示,Ad41E4orf6既能与Ad41E1B55K结合,也能与Ad5E1B55K相互作用,形成的E3泛素连接酶复合物均能降解底物p53及Mre11蛋白。3.E3泛素连接酶复合物对病毒晚期mRNA出核转运的影响。293细胞表达Ad5E1B55K,而293TE7细胞主要表达Ad41E1B55K;Ad41GFP携带Ad41E4orf6基因。将Ad41GFP分别接种至293及293TE7细胞中,然后分别提取各自的胞浆及核内RNA,通过real time PCR对其晚期蛋白mRNA的出核转运情况进行了分析,从实验结果可以看出,Ad41GFP以150MOI感染细胞24h,293TE7细胞中病毒晚期基因(penton, hexon, long fiber)胞浆与核内mRNA的比例明显高于293细胞,而细胞基因actin的该比值却相反,表明Ad41E1B55K与Ad41E4orf6蛋白形成的E3泛素连接酶复合物能促进Ad41病毒晚期蛋白的出核转运,抑制细胞蛋白的出核转运,而Ad5E1B55K不能完全替代Ad41E1B55K的功能。E1B55K与E4orf6蛋白相互作用和对E3泛素连接酶已知底物的降解研究提示,293细胞可以用于重组Ad41的有效包装(Ad5E1B55K能够与Ad41E4orf6相互作用并降解底物);但293细胞中病毒晚期mRNA的转运效率较293TE7细胞低,这部分解释了293不是理想的Ad41包装细胞的原因。293TE7细胞的构建,较好地解决了Ad41的难养问题,进一步提高了重组Ad41的扩增效率。通过对异型腺病毒E1B55K与E4orf6蛋白相互作用和病毒晚期mRNA转运的研究,提示Ad5E1B55K不能完全替代Ad41E1B55K功能主要与病毒晚期mRNA转运有关。本研究初步揭示了Ad41在293细胞中难以培养而能够在293TE7细胞中有效复制的分子机理,并提示如果将Ad41载体系统中的E4orf6基因替换为Ad5E4orf6,有可能实现重组Ad41在293细胞的高效包装。实验结果同时提示E3泛素连接酶复合物不能解释病毒早期蛋白E1B55K与E4orf6蛋白的所有功能,或该复合物有其它的与病毒晚期mRNA转运有关的未知底物。