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甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是合成甜菜碱的关键酶,甜菜碱是一种非毒性的渗透调节剂,在植物耐盐中起着重要的作用。BADH基因受盐诱导表达,随着环境中盐浓度的提高,BADH基因表达量增加。该基因的诱导表达特性一定与其启动子有关。本文对辽宁碱蓬BADH基因启动子进行了研究。研究BADH基因启动子对分析BADH基因表达调控机制具有一定的理论意义,获得盐诱导启动子区段,应用于植物基因工程,对提高转基因植物的耐盐性具有重要的应用价值。
本研究利用PLACE和PlantCARE软件对已获得的辽宁碱蓬BADH基因启动子序列(1993bp)进行分析,发现该序列具有启动子的基本组成元件TATA-box、CAAT-box,包含多个胁迫诱导元件,如3个盐诱导元件GT-1 motifs(GAAAAA),6个缺水、脱落酸、抗冻、抗寒元件MYC识别位点(CANNTG),9个伤害诱导元件WUN-motifs(ANATTNCNN),11个热激元件HSE(ATAAATGT)等。
根据该启动子序列设计5个正向引物分别与1个反向引物配对,PCR扩增获得了BADH基因起始密码子上游不同长度启动子片段:P1(-1993~+62bp)、P2(-1466~+62bp)、P3(-1084~+62bp)、P4(-573~+62bp)、P5(-300~+62bp)。通过酶切、纯化、连接,各启动子片段定向插入pCAMBIA1301载体中,取代原有的CaMV 35S启动子,与GUS报告基因连接,构建了5个植物表达载体:pCAMBIA1301-P1、pCAMBIA1301-P2、pCAMBIA1301-P3、pCAMBIA1301-P4、pCAMBIA1301-P5。
5个植物表达载体经农杆菌介导的叶盘转化法分别转到烟草中,筛选出潮霉素抗性的转基因烟草阳性植株,经PCR检测、GUS检测获得阳性植株,表明各启动子片段已转入烟草中,且能驱动GUS基因的表达。
用不同浓度NaCl处理转基因烟草阳性植株48h后,GUS组织化学分析和GUS荧光定量分析,结果表明:随着盐浓度的升高,各启动子片段驱动的GUS活性增加,400mmol/LNaCl诱导时,P5(-300~+62bp)启动子片段的GUS活性是未经NaCl诱导时的6.3倍,表明P5启动子具有启动子活性,是一个强的盐诱导表达启动子。