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DNA甲基化是DNA的一种天然修饰方式,也是表观遗传学研究的重要方面之一,这种调节不改变DNA序列,并且是可逆的,在基因表达调控、胚胎发育调节、基因组印迹、X染色体失活、细胞凋亡等方面发挥重要的作用。DNA甲基化是通过DNMTs催化完成的,DNA甲基化转移酶3b(DNMT3b)是其中重要的一种,主要催化CpG岛区域的从头甲基化,目前已发现多种肿瘤中DNMT3b表达增高,而过表达的DNMT3b将导致多种抑癌基因高甲基化而失活,在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。程序性细胞凋亡因子4(PDCD4)基因是一种与细胞凋亡相关的抑癌基因,可能作用于翻译启动因子eIF4A、eIF4G,从而在蛋白翻译水平抑制细胞生长。其在肺癌、消化道肿瘤中表达下降,并通过caspase途径诱导细胞凋亡,但对于其表达下降的机制尚不清楚。研究表明,PDCD4基因启动子区域存在多个CpG岛,因此推测其表达调节可能与DNA甲基化转移酶有关。一、目的本文旨在研究DNA甲基化转移酶3b、抑癌基因程序性细胞死亡因子4在肝癌组织及肝癌细胞株中的表达,探讨两者之间作用机制,并分析PDCD4在肝癌发生发展中的作用和临床意义。二、方法1.免疫组化法观察DNMT3b,PDCD4在肝癌组织、癌旁肝组织、正常肝组织中的表达,分析其表达的相关性,并同时分析PDCD4与肝癌病理学参数的关系;2.培养人肝癌细胞株SMMC7721,提取总蛋白和基因组DNA备用;3.用不同浓度的甲基化酶抑制剂5-aza-CdR培养SMMC7721细胞,并提取其中两组细胞总蛋白和基因组DNA备用;4.分别用Western-blotting技术和MSP(甲基化特异性PCR)技术检测5-aza-CdR处理前后细胞中DNMT3b和PDCD4的表达改变以及PDCD4基因启动子区域的甲基化状况;5.用SPSS13.0进行统计学分析,得出结论。三、结果1.PDCD4在肝癌组织、癌旁肝组织、正常肝组织的阳性表达率分别为34.72%、45.83%、70.97%,正常组与癌组织、癌旁组织间有差异,正常组低于癌组织、癌旁组织,而癌组织、癌旁组织间无差异;DNMT3b肝癌组织、癌旁肝组织、正常肝组织的阳性表达率分别为70.83%、59.72%、35.48%,正常组与癌组织、癌旁组织间有差异,正常组高于癌组织、癌旁组织,而癌组织、癌旁组织间亦无差异。癌组织中PDCD4与DNMT3b的表达呈负相关,r=-0.059。2.Western-blotting示5-aza-CdR处理后,DNMT3b蛋白表达水平降低,而PDCD4表达水平升高,浓度之间有差异。3.MSP示5-aza-CdR处理前,PDCD4启动子区域处于高甲基化状态,而用5-aza-CdR处理后,发生了去甲基化。四、结论1.PDCD4在肝癌组织中表达降低,DNMT3b在肝癌组织中表达增高,两者呈负相关。2.甲基化酶抑制剂5-aza-CdR可以抑制DNMT3b在肝癌中的表达,且随着浓度的增高,抑制作用增强;5-aza-CdR通过抑制DNMT3b表达导致抑癌基因PDCD4表达水平增高。3.DNMT3b可能通过甲基化机制负调控PDCD4的表达。