论文部分内容阅读
小立碗藓是研究植物功能基因的新模式植物。小立碗藓同源重组率高以及基因组序列测定完成，使得利用基因打靶技术对其特定基因的功能进行研究成为可能。本实验室的前期研究发现，PpCalS12基因和NPR1基因可能与小立碗藓抵抗灰霉菌感染有关。为进一步证实PpCalS12基因和NPR1基因的作用机理，本研究主要开展了以下工作：1、对影响构建敲除载体的重要因素——如何提高E.coliDH5α的转化率做了准备实验。2、构建PpCalS12基因和NPR1基因的敲除载体。3、利用PEG介导法培育缺失PpCalS12基因的突变植株。 通过研究取得了以下实验结果：1、使用过滤处理的CaCl2比灭菌处理的CaCl2制备的感受态细胞转化效率高；其他条件相同，长期保存的大肠杆菌菌种活化三次以上的转化率最高；其他条件相同，制备感受态细胞第一次离心使用4℃、4000g离心15min，第二次离心时使用4℃、4000g离心5min得到的感受态细胞转化率最高。2、实验以pTN182载体、小立碗藓PpCalS12和NPR1基因的上、下游同源臂PCR产物为基础材料，通过酶切、连接等方法构建出PpCalS12.1-pTN182-PpCalS12.2和NPR1.1-pTN182-NPR1.2敲除载体。PpCalS12.1-pTN182-PpCalS12.2和NPR1.1-pTN182-NPR1.2载体的酶切验证与预期片段大小基本相符。构建的PpCalS12.1-pTN182-PpCalS12.2 PpCalS12载体测序结果与目的片段相似度为99.10％，NPR1.1-pTN182-NPR1.2载体与目的片段相似度为99.23%。3、利用PEG介导法转化PpCalS12基因，两次G418抗性筛选后得到8株再生植株。 通过本实验：1、掌握了E.coliDH5α感受态细胞转化率的优化条件。2、成功构建了小立碗藓PpCalS12和NPR1基因的敲除载体。3、得到了小立碗藓突变植株，其中可能含有缺失PpCalS12基因的突变植株。这些为进一步研究PpCalS12和NPR1基因创造了条件，也为研究小立碗藓的抗病性机理奠定了基础。