论文部分内容阅读
Pescadilo (PES1)在生物体的生命活动过程中发挥重要作用,并且在多种生物中具有高度保守性。PES1是维持酵母正常生长所必须的;在哺乳动物中,PES1与上游因子(Upstream binding factor1, UBF1)核糖体的生物合成过程中发挥协同作用;小鼠实验表明,PES1在一些细胞分裂增殖旺盛的组织中高表达,说明其可能在细胞的增殖及细胞周期中发挥了作用。此外,PES1在多种癌细胞中也是高表达的(如乳腺癌、胃癌和前列腺癌等),表明PES1可能在肿瘤的发生发展过程中也发挥了重要的作用。SUMO (Small ubiquition related modifier)化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,具有调节蛋白质的细胞定位、稳定性及活性等功能。序列分析表明,PES1含有两个潜在的SUMO化位点。因此,本文的研究重点是确定PES1的SUMO化修饰,并进一步研究SUMO化修饰对PES1功能的影响,主要内容包括:(1)在COS-7细胞中转染外源的PES1及SUMO,并通过免疫印迹和免疫共沉淀实验来验证PES1是否能发生SUMO化修饰,结果表明PES1可以发生SUMO化修饰,并且SUMO1、2、3都能发挥作用,其中SUMO1的作用最强。(2)确定PES1的SUMO化位点,先对PES1的序列进行软件分析,发现存在两个潜在的SUMO化位点,分别为249位和517位的赖氨酸。然后将其突变,再通过免疫印迹实验检测对SUMO化条带是否产生影响,发现当517位赖氨酸突变后会使条带明显减弱,说明517位的赖氨酸是PES1主要的SUMO化位点。(3) SUMO化修饰通常会影响蛋白在细胞内的定位及稳定性,通过免疫荧光实验及半衰期实验来验证SUMO化修饰对PES1这两方面的影响,发现SUMO化修饰不影响PES1的细胞定位但SUMO化位点突变后会降低PES1的稳定性。(4)对SUMO化修饰调控PES1的功能进行研究,利用的是荧光素酶报告基因实验和MTT实验,发先PES1的SUMO化能增强PES1的转录激活作用,同样增强了PES1的促细胞增殖作用。本研究证实了PES1的一种重要翻译后修饰即SUMO化修饰,并发现SUMO化修饰能影响PES1对乳腺癌细胞的细胞增殖促进作用,暗示PES1在乳腺癌的发生发展中可能起重要作用,为研究乳腺癌发病机理提供一个新的思路。