目的：食管癌( esophageal cancer，Ec)是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，主要有鳞癌和腺癌两种病理类型，在我国以鳞癌多见。全世界每年约有22万人死于食道癌，我国是食道癌高发区。食道癌死亡者仅次于胃癌居第四位，其主要诱因是不良饮食习惯及亚硝胺慢性刺激、炎症与创伤，遗传因素以及饮水、粮食和蔬菜中的微量元素含量有关。已有研究证明人们所摄取的食物中既含有抗癌成分也有促癌成分，所以寻找食品级的抗癌成分用以食管癌的预防与治疗具有十分重要的意义。现阶段，食管癌患者的治疗手段主要是手术治疗、放疗和化疗。细胞毒药物治疗有非常重要的作用，但化疗药物疗效有限，并且其肾毒性和免疫抑制作用常使患者生活质量严重下降，建议患者术后用一些性质较温和的具有抗癌作用同时能提高免疫功能的药物。　　 叶黄素(lutein)是一种天然植物提取物，自然界广泛存在的类胡萝卜素，可以提高人体的免疫能力，也是一种抗氧化剂，对老年视黄斑退行性变化有很好的预防作用，有研究表明，叶黄素对一些类型的癌症具有预防效果。国外大量的流行病学数据显示，叶黄素在阻断肿瘤、心血管疾病的发生与发展、预防视黄斑退化和增强机体免疫力等方面都有着广泛的生物学活性。目前我国叶黄素的应用仅仅局限于饲料行业，食品和医药行业未充分重视对其生物学活性和生物学效应的研究。国内学者王明臣等研究显示叶黄素具有明显的抗氧化、抗衰老以及抗突变等生物学效应。　　 目前癌症的治疗，西医主要采取手术、放疗、化疗、免疫疗法、而中医疗法即可与其配合，也可单独使用。鉴于中医这种优势该课题拟在前期研究的基础上，利用生化及分子生物学技术，以人食管癌细胞株Ec-109细胞作为研究对象，探讨叶黄素对Ec-109细胞的增殖抑制和诱导分化效应及其分子机制，以期为食管癌的干预阻断与防治提供新的线索和途径。中医治疗扶正固本，改善患者的饮食睡眠情况，提高自身的免疫功能，增强患者的体质，那么对防止癌症的复发和转移将会大有益处。　　 方法：　　 1.按要求常规培养人食管癌Ec-109细胞株，测定并绘制该细胞株的生长曲线，获得细胞进入对数生长期的准确时间和基本生长状况。　　 2.应用光学显微镜观察细胞的形态学变化：将配置的不同浓度的叶黄素溶液作用于Ec-109细胞，在倒置相差显微镜下定时观察细胞的生长情况并爬片、照相。　　 3.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定叶黄素对Ec-109细胞的生长抑制作用：并计算细胞增殖抑制率。　　 4.应用吉姆萨染色法观察不同浓度叶黄素作用不同时间后Ec-109细胞形态的改变。　　 5.采用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡、细胞周期分布：收集经不同浓度叶黄素作用24h、48h、72h的Ec-109细胞及对照组细胞，流式细胞仪上机检测，应用软件进行分析。　　 6.应用免疫细胞化学方法观察Fas、PCNA、细胞周期素cyclin A蛋白表达的变化。　　 7.采用透射电镜观察不同浓度叶黄素作用不同时间后Ec-109细胞的超微结构改变。　　 8.所有实验数据采用SPSS13.0 for windows统计软件分析处理。多组间的比较采用单因素方差分析，组内两两比较用g检验。P＜0.05差异具有统计学意义。　　 结果：叶黄素对Ec-109细胞的体外生物学作用　　 1.加入40、80、160μmol/L不同浓度叶黄素处理的Ec-109细胞24h、48h和72h后，倒置相差显微镜下观察，与对照组相比较，用药组细胞数量明显减少，部分细胞体积缩小，细胞质胞核浓缩，细胞质内颗粒增多增粗，核浆比例增高，部分细胞膜向细胞膜外呈球形膨出，细胞变圆并悬浮于培养基中。提示Ec-109细胞生长受到抑制并随时间延长浓度的改变而趋向凋亡甚至产生毒性改变。　　 2.分别使用叶黄素(0、40、80、160μmol/L)浓度的叶黄素作用于Ec-109细胞24h、48h、72h后，MTT试验结果显示叶黄素能较明显抑制Ec-109细胞的增殖，并其对呈剂量和时间依赖性。分别作用24h、48h和72h后，Ec-109细胞半数抑制率(inhibitory concentration giving50％inhibition，IC50)分别为43.21μg/ml，14.67μg/ml和9.15μ,g/ml(p＜0.01)。应用160μmol/L叶黄素处理Ec-109细胞72h后，其增殖抑制率最大可以达到83.27％。　　 3.使用流式细胞仪分析细胞凋亡的情况，在DNA组方图上出现典型的亚二倍体峰即“凋亡峰”。40、80和160μmo1/L叶黄素作用72h后凋亡率分别为18.13±2.78％、29.46±2.05％和40.06±1.17％，与对照组的5.75±4.02％相比，差异有显著性(P＜0.01)。并做各用药浓度组作用不同时间细胞凋亡率的方差分析，表明差异有显著性(P＜0.05)。Pearson关联性分析说明Ec-109细胞凋亡率与叶黄素作用呈剂量和时间依赖关系。　　 4.吉姆萨染色光学显微观察：镜下观察可见阴性对照组Ec-109细胞呈多边形，核深染呈紫红色，细胞质淡蓝色，细胞核大，细胞质少，核质比大，呈现典型恶性肿瘤细胞特征；而经叶黄素处理细胞形态发生明显变化，多呈椭圆形、梭形或不规则形，细胞质呈浅蓝色，细胞核小，个别发生空泡变性。提示叶黄素诱导其成熟分化，细胞恶性程度降低。　　 5.加入0、40、80、160μmol/L浓度的叶黄素对Ec-109细胞分别作用24h、48h、72h后进行免疫细胞化学检测，对照组中，Fas蛋白在细胞中呈阴性表达、cyclin Dl和PCNA表达水平较高，结果表明叶黄素作用后，细胞中的Fas蛋白表达水平明显升高；cyclinA和PCNA蛋白表达则降低。　　 6.加入160μmol/L叶黄素对Ec-109细胞作用72h后透射电镜观察，可见细胞体积明显缩小表面突起消失，细胞质内空泡化及染色质边集等超微结构改变，提示细胞凋亡己开始发生。　　 结论：　　 1.通过MTT试验结果显示叶黄素可以在体外较明显抑制人食管癌Ec-109细胞的增殖，并观察发现其具有时间和剂量依赖性。　　 2.流式细胞术分析显示，叶黄素可以明显影响Ec-109细胞的增殖周期，将Ec-109细胞阻滞于G0/G1期，加快细胞凋亡。　　 3.通过叶黄素作用后Fas高表达，cyclinA和PCNA蛋白出现表达明显降低，提示叶黄素对Ec-109细胞具有增值抑制和凋亡诱导的作用。　　 4.在透射电镜下可见经160μmol/L叶黄素作用72h后的Ec-109细胞有明显的形态学改变并可见凋亡小体，提示叶黄素可诱导Ec-109细胞凋亡。