类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以关节滑膜炎症和滑膜异常增生为特点,从而侵蚀邻近的软骨和骨组织,最终导致不可逆转的关节损伤,为人类最常见的自身免疫性疾病之一。大量的实验指出,异常增殖活化的成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS),可分泌多种炎症介质,从而引起滑膜损伤,是类风湿性关节炎发生发展过程中的重要事件。因此,通过抑制FLS细胞的活化增殖是治疗类风湿性关节炎的一种方法。文献提示,Wnt信号通路调节控制着许多细胞生物过程,其中包含细胞的生长、增殖和凋亡等。其中,经典的Wnt信号通路在肝癌,宫颈癌,胃癌,黑色素瘤等多种癌症的发生发展中发挥了极其明显的作用。分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)是一种细胞外的一种分泌性蛋白,同时它也是Wnt信号通路上游的一种拮抗剂。在多种癌细胞中发现,SFRP2在甲基化转移酶1(DNMT1)催化下,自身可发生甲基化而导致其表达显著降低,从而激活经典的Wnt信号通路。类风湿性关节炎中SFRP2是否发生甲基化从而激活Wnt信号通路促进FLS细胞的异常增殖,还未见文献报道。越来越多的文献表明中药在类风湿性关节炎的预防和治疗方面起着至关重要的作用。橙皮素(Hesperidin,HDN)是一种黄酮类化合物,主要存在于柑橘类水果中。它也是传统中药陈皮的主要成分。已知黄酮类化合物,包括HDN,具有多种生物学功能,例如抗炎、抗风湿、抗病毒和抗癌等生物活性。因此,本课题组前期合成并改进了一些橙皮素衍生物,实验筛选发现橙皮素衍生物11(HDND-11)可抑制滑膜细胞增殖,通过MTT实验检发现HDND-11对FLS细胞的增殖和活化有显著地抑制作用,并可促进SFPR2的表达。那么HDND-11对类风湿关节炎是否有治疗作用,其作用机制是否与促进SFRP2的表达有关,本实验就此问题进行了研究。本课题以AA大鼠模型为对象,研究HDND-11对类风湿关节炎的治疗作用及其可能的作用机制,实验分以下6个部分。1、HDND-11对AA大鼠模型的治疗作用。雄性SD大鼠通过右后足趾皮内注射完全佐剂(CFA),建立AA大鼠模型。通过HE染色、关节炎评分、足肿胀评分以及ELISA检测大鼠关节的炎症程度。实验结果表明,HDND-11对关节炎具有明显的治疗效果。2、HDND-11抑制大鼠FLS的增殖的研究。通过用MTT方法,检测0,12.5,25,50,100,200μM六个不同浓度的HDND-11作用FLS细胞48h以及使用HDND-11(100μM)分别作用FLS细胞6h,12h,24h和48h,从而判断HDND-11对FLS细胞的增殖的影响。此外,采取流式细胞术检测HDND-11对FLS细胞增殖和细胞周期分布的影响。实验结果表明,HDND-11能够显著地抑制FLS细胞的增殖。3、HDND-11促进AA大鼠滑膜组织和FLS细胞中SFRP2的表达的研究。通过用免疫组化、Western blot以及RT-q PCR方法检测滑膜组织中SFRP2的表达,用Western blot、RT-q PCR以及免疫荧光检测FLS中SFRP2的表达。实验结果表明,与正常组相比较,AA滑膜组织和AA-FLS中SFRP2的表达显著降低,且HDND-11能够显著促进模型组滑膜组织和FLS细胞中SFRP2的表达。4、SFRP2对FLS细胞增殖的研究。鉴于SFRP2在AA-FLS细胞中低表达,本文采用脂质体Lipofectamine TM2000转染PEGFP-N1-SFRP2作用于AA-FLS细胞,用Western blot、RT-q PCR以及免疫荧光检测FLS中SFRP2的表达。实验结果表明,SFRP2过表达质粒构建成功。通过MTT和流式细胞术(FCM)方法检测过表达的SFRP2对AA-FLS增殖的影响。实验结果表明,过表达的SFRP2能够显著抑制AA-FLS的增殖。5、HDND-11促进AA大鼠滑膜组织和FLS细胞中SFRP2表达机制的研究。用Western blot以及RT-q PCR方法检测滑膜组织中DNMT1的表达,用Western blot、RT-q PCR以及免疫荧光检测FLS中DNMT1的表达。实验结果表明,与正常组相比较,AA滑膜组织和AA-FLS中DNMT1的表达显著升高,且HDND-11能够显著抑制模型组滑膜组织和FLS细胞中DNMT1的表达。用Western blot和RT-q PCR两种实验方法检测DNMT1对SFRP2蛋白及RNA表达的影响。实验结果表明,沉默DNMT1基因的表达能够显著升高SFRP2基因的表达。6、HDND-11、SFRP2以及DNMT1对Wnt信号通路的影响。通过Western blot检测HDND-11对滑膜组织及FLS细胞中β-catenin,C-myc和cyclin D1的表达的影响。实验结果表明,HDND-11能够显著抑制滑膜组织及FLS细胞中β-catenin,C-myc和cyclin D1的表达,即HDND-11能够抑制Wnt信号通路。通过Western blot检测过表达的SFRP2和沉默的DNMT1对FLS细胞中β-catenin,C-myc和cyclin D1三种Wnt信号下游效应基因的表达的影响。最终的实验结果表明,过表达的SFRP2和沉默的DNMT1能够显著抑制FLS细胞中β-catenin,C-myc和cyclin D1三种基因的表达,即高表达的SFRP2基因和低表达的DNMT1基因能够抑制经典的Wnt信号通路。