周围神经损伤是临床外科常见的疾病之一,其治疗及功能恢复长期以来都是临床医生面临的一项重要挑战。目前临床上自体神经移植是周围神经缺损修复的“金标准”,但由于其存在来源受限、牺牲供区次要神经功能等因素其临床应用受到限制,因此人工神经为临床修复提供了一个新思路,成为目前周围神经损伤修复的研究热点。近年来随着组织工程技术的发展,众多的材料被应用于人工神经的制备。蚕丝具有高韧性以及良好的生物相容性,是一种常见的组织工程材料。本课题组前期研究表明利用蚕丝纤维构建的微通道人工神经导管在引导和促进再生神经纤维的生长方面有显著的效果,但是其在体内却难以降解;在随后的研究中发现,在炎症反应中的细胞吞噬作用是其在体内降解的主要因素之一,同时在神经损伤修复早期,适度的炎症反应也有助于促进损伤神经的修复。研究表明,当周围神经组织损伤后,炎症反应随即被触发,损伤处以及远端全长神经纤维发生瓦勒氏变性(Wallerian degeneration,WD),在此过程中,巨噬细胞吞噬变性的组织碎片,为神经再生扫除障碍,雪旺氏细胞增殖活化形成Büngner带,并且分泌神经营养因子,促进轴突的再生。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分,其作为一种典型的免疫应答激活剂,可通过激活相应的TLRs信号通路有效刺激巨噬细胞和神经胶质细胞活化,诱导体内的炎症反应。基于以上原因,本研究构建含LPS的蚕丝纤维微通道复合人工神经导管,一方面通过LPS在一定时间内的持续释放,诱导适度的炎症反应,加快大鼠坐骨神经损伤后炎性细胞的募集及瓦勒氏变性过程中轴突和髓鞘碎片的清除;另一方面促进巨噬细胞对蚕丝纤维的吞噬,从而进一步促进蚕丝纤维的体内降解;旨在从免疫学角度,缩短神经损伤后瓦勒氏变性的时间,加快神经再生速度以及改善神经导管的修复效果,为人工神经导管的深入研究以及周围神经的辅助治疗提供新思路。为了探讨LPS的含量对炎性细胞的影响,本研究首先使用不同剂量的LPS对大鼠进行尾静脉注射,利用全自动血细胞分析仪进行血常规检测;随后利用海藻酸钙凝胶为缓释载体,制备了载LPS的蚕丝纤维微通道复合人工神经导管,检测其在周围神经缺损修复中的作用,为此本研究共设计了3种人工神经导管,在大鼠坐骨神经10 mm缺损动物模型中分别进行了4种移植方案,即:自体神经移植组(对照),熟丝组,凝胶组和LPS组。在移植后的相应时间点分别进行坐骨神经功能指数(SFI)检测、HE染色和免疫荧光染色观察,以此评价3种人工神经导管修复神经缺损的效果,以及在修复过程中炎性细胞的活动;最后,利用实时荧光定量PCR测定损伤修复过程中溶酶体相关基因和炎性细胞因子的表达情况,探讨炎症反应以及蚕丝降解活动在周围神经损伤修复中的变化。实验结果显示:1.大鼠血常规分析结果显示:低剂量(1μg/kg)LPS和中剂量(100μg/kg)LPS均可显著诱导大鼠血液中白细胞增生,而高剂量(10 mg/kg)LPS导致白细胞数减少,提示一定剂量的LPS可诱导大鼠产生适度的炎症反应。2.人工神经体外测试:(1)LPS在神经导管中的体外缓释结果显示:LPS在前7天释放速度较快,而后释放速度逐渐趋于平缓,在第21天时累积释放量为2444.2 EU,释放基本结束,以上结果表明载LPS的蚕丝纤维微通道复合人工神经导管能够在一定程度上对LPS缓慢释放,具有良好的缓释效果。(2)人工神经导管材料与雪旺氏细胞共培养,CCK8测定结果表明:3种人工神经对雪旺氏细胞无明显毒性,并表现出良好的生物相容性。3.人工神经修复效果评价:(1)HE染色观察显示:各组移植体神经纤维再生状况良好,术后第12周,3种人工神经导管内的蚕丝纤维均出现不同程度的降解,其中,LPS组单位面积残余的蚕丝纤维数量最少,表明LPS的添加促进了蚕丝纤维在体内的降解。(2)免疫荧光观察显示:术后第1周,4组移植体近、远端神经组织均被大量巨噬细胞浸润,其中,LPS组巨噬细胞数量显著高于其他移植组;在移植体近、远端均观察到脱髓鞘现象,与近端相比,远端脱髓鞘程度较高,各组中,LPS组残余的轴突和髓鞘碎片最少。术后第12周,各组移植体中均检测到大量的雪旺氏细胞和再生轴突,自体移植组中雪旺氏细胞和再生轴突最多,其余3组中,雪旺氏细胞和再生轴突数量由多至少依次为:LPS组、凝胶组、熟丝组。(3)术后第2、4、12周坐骨神经功能指数(SFI)结果表明,各组SFI随时间的推移逐渐恢复,其中LPS组显著优于其他人工神经组,修复效果最接近自体移植组。4.实时荧光定量PCR结果显示:促炎细胞因子IL-6 mRNA、TNF-αmRNA在神经损伤后第3天开始显著上调,抗炎细胞因子IL-10 mRNA则在神经损伤后第2周开始显著上调,稍晚于促炎细胞因子;在损伤前2周LPS组IL-6 mRNA的相对表达量均显著高于其他组。各移植组溶酶体相关基因的mRNA均在术后不同时期显著上调,其中Ctsd mRNA在第4周显著上调。Hip1r mRNA在第1周开始显著上调,而Plat mRNA在第3天开始显著上调。综上实验结果表明:本研究构建的脂多糖/蚕丝纤维/PLA复合人工神经导管能够诱导适度的炎症反应,加快神经损伤早期瓦勒变性过程中轴突和髓鞘碎片的清除,从而促进坐骨神经的结构重建和功能恢复;另外,LPS的添加对蚕丝纤维在体内的降解也有一定的促进作用。