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禽白血病病毒(ALV)自从1989年报道以来,给世界养禽业带来了严重的危害。该病可使感染鸡群产蛋量下降、继发或/和混合感染多种疾病,引起鸡群的死淘率上升,免疫抑制增强,以及多种类型的肿瘤,损失重大。该病到目前为止还没有有效的疫苗和治疗方法。p27蛋白(ALV-p27)是病毒编码的群特异性衣壳蛋白,在病毒中含量高,有许多易于检测的抗原位点,常被用于ELISA和免疫荧光的检测。有研究表明p27可以影响一些细胞因子的表达,提示ALV-p27可能在病毒感染引起的免疫抑制中发挥一定的作用。为了明确p27对免疫的影响,本研究在构建pcDNA3.1-p27全长真核表达载体,以及p27分段表达载体的基础上,探究p27蛋白的免疫抑制机理。1.ALV-p27抑制DF-1细胞对LPS和Poly(I:C)的刺激为了研究在LPS和Poly(I:C)刺激后,过表达的ALV-p27在DF-1细胞中产生的免疫抑制作用,本研究利用实验室已构建的pcDNA3.1-p27真核表达载体为模板,并成功克隆构建了 p27的两个分段表达载体pcDNA3.1-p27A(1-480bp)和pcDNA3.1-p27B(241-720bp)。将全长的p27质粒和空载体质粒分别转染DF-1细胞中,随后用LPS和Poly(I:C)刺激物刺激,分别在1,6,12和24h收集细胞,提取RNA,利用Real-timePCR检测IL-1β、IL-6、IFN-β等细胞因子的表达情况。结果表明,DF-1细胞中过表达的p27蛋白显著影响免疫相关细胞因子的表达。进一步研究发现,分段表达载体pcDNA3.1-p27A(1-480bp)和 pcDNA3.1-p27B 转染的 DF-1 细胞中,pcDNA3.1-p27B 具有抑制细胞因子表达的作用,提示p27蛋白发挥免疫抑制作用的位点位于480-720bp,即蛋白C端。这一结果说明ALV-p27蛋白可能通过抑制细胞因子的表达抑制机体的免疫反应。2.ALV-p27抑制DF-1细胞免疫反应机理的初步研究为了进一步探讨ALV-p27在DF-1细胞中产生免疫抑制作用的相关机理,利用Real-time PCR的方法检测了 LPS和Poly(I:C)刺激细胞后,相关信号通路途径的一些关键分子的基因表达,结果表明,LPS刺激后,其信号通路中的IRAK4和IRF-7基因表达受到明显抑制;而Poly(I:C)刺激后,基因水平上该信号通路的常见分子未发生显著变化。利用双荧光酶报告系统进一步研究发现,Poly(I:C)刺激后,p27蛋白可通过抑制IFN-β基因表达的启动子抑制基因表达;LPS刺激后可抑制IRF-7的启动子活性产生免疫抑制作用;而MAPK相关信号通路分子蛋白磷酸化实验结果表明,LPS和Poly(I:C)刺激后,p27蛋白明显抑制p38蛋白的磷酸化水平从而抑制下游基因的表达。以上实验结果表明,ALV-p27可能通过抑制信号通路相关基因分子表达、抑制细胞因子表达的启动以及影响信号通路关键蛋白的磷酸化发挥免疫抑制作用。