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视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞和光感受器细胞的丢失、变性或坏死均可导致一系列视网膜变性疾病,包括视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP),老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD),先天性黑朦(Lebers congenital amaurosis,LCA)和视锥-视杆细胞营养不良(cone-rod dystrophy,CORD)等疾病。目前,国内外尚无该类严重性致盲性疾病的有效治疗手段。关于干细胞替代性治疗视网膜变性疾病的可行性和有效性,近年来成为该领域的研究重点和热点。胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)具有分化的多潜能性,来源稳定且能在体外大量扩增,使其成为治疗视网膜变性疾病的一个研究热点,为视网膜变性疾病提供一种全新的治疗模式,为有效治疗严重致盲性眼部疾病带来了希望。研究发现,在一定的培养条件下,ESCs能被诱导分化为神经细胞、胰岛细胞、造血细胞、心肌细胞、骨细胞和肝细胞等,涵括了内、中、外三个胚层的所有细胞和组织,包括RPE细胞和光感受器细胞。因此,ESCs诱导为眼治疗细胞,将成为治疗严重致盲性眼部疾病的一种新途径。迄今为止,ESC向视网膜祖细胞(retinal progenitor cells,RPCs)分化的主要方法有自然分化法,基质细胞诱导(stromal cell-derived inducing activity,SD IA)培养法,无血清的拟胚体(serum-free embryoid body–like,SFEB)培养法和改良的SFEB/DLFA培养法。研究发现,ESCs具有分化为内、中、外三个胚层的所有细胞和组织的能力,在不添加任何诱导剂的情况下,约有1%的ESCs自发分化为RPE细胞,该方法耗费时间长(42天-56天)且目的细胞生成率低;Kawa saki H等将小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,m ESCs)与基质细胞共培养后成功诱导出神经元,此种方法称为SDIA培养法,该方法诱导出的神经元大多数为中脑多巴胺能神经元,SDIA法尚未诱导出光感受器细胞,而且m ES Cs与基质细胞共培养容易出现污染;2005年Ikeda等用SFEB法成功诱导出Rax+/Pax6+的视网膜祖细胞(Retinal progenitor cells,RPCs),与SDIA法相比,SFEB法成功诱导出RPCs,且RPCs生成效率高(>50%),与自然分化法相比诱导分化时间至少缩短25天,但SFEB法必须与胚胎视网膜共培养才能得到成熟的光感受器细胞;在SFEB法的基础上,Osakada等人采用改良的SFEB/DLFA法,在诱导分化的特定时间点加入γ-促分泌酶抑制剂(N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alan yl]-2-phenylglycine tert-butyl ester,DAPT),酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor,a FGF),碱性成纤维细胞生长因子(basic fibro-blast growt h factor,b FGF),视磺酸(retinoic acid,RA)等小分子诱导剂,成功诱导出RPE细胞和成熟光感受器细胞,与SFEB/DLFA法相比,不仅提高了ESCs向RPCs的分化效率,并避免与胚胎视网膜共培养的过程。基于上述研究成果,本实验采用改良的SFEB/DLFA法将m ESC定向诱导分化为RPCs,通过应用细胞免疫荧光和流式细胞技术对RPCs的特异性标记物Pax6、Sox2和Otx2进行鉴定,检测三者在m ESC分化为RPCs过程中的基因表达,为进一步研究m ESC向成熟光感受器细胞分化提供依据。本实验分为三个部分:第一部分:m ESCs的培养与鉴定第二部分:m ESCs诱导分化为RPCs的培养与鉴定第三部分:小鼠RPCs分化发育过程中基因表达目的1.对V6.5小鼠ESCs进行体外培养及扩增,并鉴定该株小鼠胚胎干细胞的干性和增殖能力。2.探讨m ESCs定向诱导分化为RPCs的体外培养方法。3.研究RPCs分化发育过程中Pax6、Sox2和Otx2基因的表达。方法本研究采用m ESCs(V6.5细胞株),使其稳定传代扩增,用细胞免疫荧光染色法和流式细胞技术对m ESCs进行m ESCs标记物阶段特异性胚胎抗原1(stage sp ecific embryonic antigen 1,SSEA1)、增殖能力(Ki67)、细胞周期和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)的鉴定,在无血清条件下将m ESCs悬浮培养形成拟胚体(embryoid bodies,EBs),并在培养基中添加抑制因子1(Dicckopf-1,DKK1)、L efty-A和γ-促分泌酶抑制剂(N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-2-phenylglycine tert-butyl ester,DAPT)等将m ESCs诱导分化为RPCs,在分化的第0天,第10天和第20天,分别进行RPCs发育过程中Pax6、Sox2和Otx2的基因表达、增殖能力和细胞周期的检测。结果1.m ESCs生长良好,能在体外大量扩增,细胞免疫荧光染色和流式细胞技术鉴定增殖能力标记物Ki67和细胞周期显示Ki67阳性表达,细胞周期检测m ESC G2+S=(81.93±1.32)%,提示该株m ESC状态良好,增殖活跃。2.成功地定向诱导分化为RPCs,RPCs特异性标记物Pax6、Sox2和Otx2呈阳性表达,流式细胞检测分化第20天,Pax6、Sox2和Otx2阳性表达率分别为(50.87±2.97)%、(49.10±2.6)%和(32.01±3.87)%,Ki67和细胞周期检测均显示诱导分化第20天的RPCs仍具有一定的增殖能力。3.在m ESCs向RPCs发育分化过程中,细胞免疫荧光染色显示第5、10、20天的Pax6、Sox2和Otx2均表达阳性,流式细胞技术检测发现Pax6和Sox2呈现先增高后降低的趋势,并在第10天达到高峰值,分别为(77.30±2.50)%和(91.89±1.50)%;Otx2表达逐渐升高,第20天达到(32.01±3.87)%。结论1.m ESCs在体外培养,能保持其胚胎干细胞的干性和自我增殖能力,可用于下一步定向诱导分化的实验。2.在特定的诱导因子作用下,m ESCs可定向诱导分化为RPCs。3.在m ESCs定向诱导RPCs分化过程中,Pax6、Sox2呈现先增高后降低的趋势,第10天达到高峰值,Otx2表达从第0~20天逐渐升高。RPCs体外诱导分化过程中基因发育与小鼠体内RPCs发育过程中基因发育顺序一致。