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本文通过构建Ad-PDZ1-GFP重组体并包装获得其病毒颗粒，用以研究了PDZ1过表达能抑制由KA诱导的大鼠海马神经元的凋亡及其机理。旨在探讨通过基因治疗的方法阻断G1uR6·PSD-95·MLK3·JNK信号通路，为临床治疗脑缺血提供理论线索。
1.Ad-PDZ1-GFP重组体的构建及包装采用RT-PCR法从大鼠海马中扩增出大鼠PDZ1的cDNA，克隆到含绿色荧光蛋白(GFP)的pAdTrack-CMV穿梭载体，克隆的大鼠的PDZ1结构域经序列测定后证明与已发表的大鼠海马PSD-95的PDZ1结构域序列完全一致。重组体被内切酶PmeI直线化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电穿孔法共转染到E.coli.BJ5183中原核重组。重组体经卡那霉素筛选后进行酶切鉴定。鉴定后的重组体被内切酶PacI直线化后用脂质体转染到腺病毒包装细胞系293H。经过七至十二天培养，在荧光显微镜下293H细胞发绿色荧光。结果提示重组的腺病毒被包装完成。
2.PDZ1过表达能抑制由KA诱导的大鼠海马神经元的凋亡从怀孕19天左右的大鼠中剥离胎鼠并取得胎鼠的海马，经胰酶消化后得到的神经元细胞接种到细胞培养板(瓶)内。用NB培养基(含B-27)培养21天后加入病毒颗粒感染细胞，24小时后加入KA(终浓度200μM)作用10分钟，换L-DMEM培养基继续培养24小时，用DAPI染色后观察细胞形态。在荧光显微镜下可观察到KA+Ad-PDZ1-GFP组细胞凋亡数量与KA或KA+Ad-GFP组相比明显减少(P＜0.05)。结果提示PDZ1过表达能抑制由KA诱导的大鼠海马神经原的凋亡。
3.PDZ1过表达能抑制由KA诱导的大鼠海马神经元MLK3和JNK1/2磷酸化海马神经元用NB培养基(含B-27)培养21天后加入病毒颗粒感染细胞，24小时后加入KA作用10分钟，收集海马神经元，用p-MLK3或p-JNK1/2抗体免疫印迹，KA组和KA+Ad-GFP组条带灰度明显深于正常组(P＜0.05)，而KA+Ad-PDZ1-GFP组条带灰度明显浅于KA组(P＜0.05)。结果提示PDZ1过表达能抑制由KA诱导的大鼠海马神经元MLK3和JNK1/2磷酸化。
结论成功构建了Adenoviruse-PDZ1-GFP重组体，得到了具有能感染大鼠海马神经元并在CMV启动子的作用下高效表达PDZ1的腺病毒颗粒。过表达的PDZ1能够阻止由KA诱导的大鼠海马神经元中MLK3和JNK1/2磷酸化，从而阻止了由KA诱导的大鼠海马神经元的凋亡。