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抗菌肽是生物体内产生的一种具有活性的小分子多肽,由于其对细菌不产生耐药性而一直受到人们的极大关注。抗菌肽不仅对细菌有抑杀作用,而且对某些病毒,肿瘤有不同程度的抑制作用。目前对抗菌蛋白质的研究,除了进行一级结构即氨基酸的序列进行分析以外,还对其高级结构与作用功能进行多方面的研究探索。已知蛋白质与基因不同,即使其一级结构完全一致的活性物质,如果其高级结构不同,其活性作用不一定相同,甚至没有活性;蛋白质有活性中心或作用位点。CP7菌是一株高效分泌抗菌物质的多粘类芽孢杆菌,本实验室经过连续几年的研究,现已明确该菌能分泌抗G+,G-和真菌的三类抗菌物质,其中抗G+组分是一种由23个氨基酸组成、分子量为2510道尔顿的新型阳离子多肽,命名为Cpacin。为了更好的开发利用Cpacin,本研究在已有研究的基础上,利用微生物学、生物信息学等手段分析抗菌肽Cpacin的抗菌活性中心,并通过改造,进一步提高其抗菌活性,以期能为该抗菌蛋白的开发利用提供理论依据。主要获得结果如下:
1.通过瑞士生物信息学研究所蛋白质分析专家系统,ProtScale工具,对抗菌肽Cpacin的正电荷含量、疏水性位点、亲水性位点进行分析,得出其含有3个净的正电荷;两个亲水位点在9位丙氨酸和14位半胱氨酸;最大疏水位点在5位谷氨酰胺。利用HyperChem8.07分子结构分析软件,做出了Cpacin的三维立体结构模型图。
2.在两个最大疏水位点将Cpacin分割成LLLAQPTAA(LA-10)和RGRCQVQRYLLAA(RA-13)2个片段并人工合成,用琼脂凝胶内扩散法,测抑菌圈大小,比较其抗菌活性,得出RA-13(RGRCQVQRYLLAA)有活性。然后对RA-13再分割和去除Gly等的活性检验,证实Cpacin的活性中心是RRCQVQRYLLAA(RA-12)。继而对RA-12中的带电氨基酸,疏水性氨基酸,亲水性氨基酸分别去除,化学合成,验证了各类氨基酸对抗菌活性的重要性。
3.将活性结构部分中一些氨基酸作替换,替换的氨基酸与原氨基酸的氨基酸残基尽可能相似,以确保片段的二级结构不发生变化,替换后合成3条短肽,分别是RRA-12(RRRQVQRYLLAA),RTA-12(RRCQTQRYLLAA),RLA-12(RRCQVQRLLLAA)。其中RRA-12活性增强。RLA-12活性丢失,证明酪氨酸是抗菌活性所必须氨基酸。
4.用荧光光谱法测量LA-23,RA-12,RRA-12,RLA-12四种Cpacin类似物与金色葡萄球菌DNA的结合能力。结果显示RRA-12与细菌DNA的结合作用力强。