目的 将有促软骨细胞增值作用的成纤维细胞生长因子（bFGF）与用胶原和卵磷脂包埋的壳聚糖支架有机结合，探索组织工程合适载体，了解成纤维细胞生长因子对体外培养的壳聚糖-软骨细胞复合物中软骨细胞的作用，为关节软骨缺损的修复提供实验依据。 实验材料 1．主要仪器：超净工作台，二氧化碳细胞孵育箱，光学显微镜、Olympus倒置相差显微镜及照相系统、电镜，培养瓶，96孔培养板，显微手术器械等。 2．主要试剂：高糖型DMEM培养基，rhbFGF，壳聚糖，卵磷脂，胶原，胎牛血清，Ⅱ型胶原酶，胰蛋白酶，免疫组化试剂盒，即用型SABC，Ⅱ型胶原抗体，DAB显色液，Mtt液等。 3．实验动物：4周龄日本大耳白兔。 实验方法 无菌条件下分离1只4周龄日本大耳白兔的双后肢长骨，切取双股骨髁透明软骨，切成约0.5-1mm³大小碎块，Ⅱ型胶原酶消化3.5小时，吹打，离心，清洗，收集关节软骨细胞，以3.0×10⁵／瓶种植于50ml培养瓶，加入DMEM培养液3ml，于培养箱内37℃、5％CO₂条件下培养。90％融合时胰酶传代，于第12天收集第二代软骨细胞，制成浓度为5.0×10⁷／ml细胞悬液；将多孔壳聚糖载体膜用环钻制成直径为7.0mm的圆形，浸于PBS中高压后，于无菌的卵磷脂无水乙醇液及胶原包埋24小时后置无菌操作台内自然干燥，将细胞悬液100ul均匀滴加到实验组、对照组的多孔壳聚糖三维支架上，培养箱内静置2小时后，移人96孔板，每孔一个，加入DMEM培养液200ul，每日换液。实验组培养液中加入bFGF，浓度为10ng／ml，对照组培养液不加入bFGF，其余培养条件相同。实验结果 1.大体及显微镜观察 接种细胞悬液后，支架迅速膨胀变大，体积变为原来的4倍左右，细胞呈圆形、类圆形附于支架上。随着培养时间的延长，细胞逐渐布满整个支架空隙，并有基质分泌，细胞被包埋于其分泌的基质中，大多数细胞轮廓不清，软骨细胞一壳聚糖支架复合物透光度逐渐降低;通过分泌的基质，细胞与细胞，细胞与支架之间紧密结合，形成一个牢固的整体。 2.HE染色 第二、四周组织HE染色显示支架表面及内部细胞大部分呈圆形或多角形，胞浆淡染，胞核蓝染，壳聚糖支架不规则网带状红染。随着培养时间的延长，支架内细胞量逐渐增多。实验组细胞数明显多于对照组。 3.电镜观察 见培养第三周支架表面与间隙间有形态不规则的细胞，表面有突起的伪足和分泌的基质，基质量少;第五周时明显可见细胞被包埋在其所分泌的基质中，细胞形状不规则，基质分泌多，细胞之间通过细胞突起和细胞外基质相互连接，并与支架结合紧密。实验组与对照组细胞密度及分泌物的量有差别，实验组钻附的细胞较对照组多 4.11型胶原免疫组化检测 免疫组化显示，各时相点细胞一支架复合物n型胶原均呈阳性，2周-4周阳性着色较强。相同时相点，实验组阳性表现明显强于对照组。 5.统计学分析 Mtt检测及统计学分析显示，第二周、第四周时实验组、对照组组内及实验组与对照组组间吸光密度值（OD）均有显著差异（P<0.01）。结论 （1）本实验证实了卵磷脂和胶原包埋后的壳聚糖支架，其有更好的亲水性和细胞吸附性，有利于细胞附着、生长、增殖。 （2） bFGF不仅在软骨细胞体外培养过程中有促增殖作用，在组织工程软骨体外培养过程中同样具有促进软骨细胞增殖的作用。