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目的利用高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关，建立在同一PCR反应体系中对mtDNA12S rRNA基因A1555G和C1494T热点突变可以同时进行快速筛查的技术平台，指导AmAn的合理用药，从根本上全面预防AAID的发生。方法mtDNA12S rRNA基因PCR产物克隆至pMD19-T载体，转化E.coli JM109感受态细胞，通过LB/Amp/IPTG/X-gal平板筛选白色克隆，载体通用引物对其进行菌液PCR扩增初步确定阳性克隆，并通过序列分析进行确证，得到mtDNA12S rRNA基因的野生模板质粒。反向PCR对其野生质粒模板实施体外mtDNA12S rRNA基因A1555G和C1494T定点突变，Dpn I内切酶降解甲基化的野生质粒DNA模板后，再次转化E.coli JM109感受态细胞，同前筛选阳性克隆，测序鉴定得到mtDNA12SrRNA基因C1494T和A1555G突变质粒模板。进一步设计与mtDNA12S rRNA基因A1555G和C1494T突变位点配对及三末端不配对的3’硫化修饰正向引物，在其下游设计一条公共反向引物，分别构成野生检测引物与突变检测引物，对mtDNA12SrRNA基因野生质粒模板和A1555G和C1494T突变质粒模板，进行高保真DNA聚合酶介导的双向引物延伸反应，利用凝胶成像系统对其PCR结果进行分析。并将其优化的PCR体系用于临床健康志愿者mtDNA12S rRNA基因C1494T和A1555G突变的筛查。结果当突变检测引物与突变模板mtM配对时，引物被延伸，有PCR产物；与野生模板mt不配对时，引物却不能被延伸，无PCR产物。同样，野生检测引物只有与野生模板mt匹配时得以延伸，而与突变模板mtM不匹配时则不能延伸。突变敏感性分子开关对40例临床健康志愿者mtDNA12S rRNA基因C1494T和A1555G突变的筛查未发现C1494T和A1555G突变携带者。结论高保真DNA聚合酶偶联硫化修饰引物构成的突变敏感性分子开关能够快速筛查mtDNA12S rRNA基因A1555G和C1494T突变，达到非此即彼的二元化效果，该分子开关在AAID基因筛查中具有较大的潜在应用价值。目的利用高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关，建立在同一PCR反应体系中对NSHL患者GJB2基因235de1C、299-300delAT、176del16bp、35de1G突变，SLC26A4基因IVS7-2A>G、H723R突变，mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T突变8个热点突变可以同时进行快速筛查的技术平台，达到指导个体化用药及为优生优育咨询提供保障的目的，造福耳聋患者。方法GJB2基因PCR产物与SLC26A4基因重叠PCR拼接的DNA片段分别克隆至pMD19-T载体，转化E.coli JM109感受态细胞，通过LB/Amp/IPTG/X-gal平板筛选白色克隆，载体通用引物对其进行菌液PCR扩增初步确定阳性克隆，并通过序列分析进行确证，得到GJB2基因与SLC26A4基因的野生模板质粒。GJB2基因4条反向定点突变引物5’末端磷酸化后，与原始野生质粒模板GJB2进行退火、延伸、连接反应形成新的突变单链，再通过引物双向延伸反应获得突变双链DNA片段，突变双链DNA片段经EcoR I、Hind III双酶切、凝胶回收后克隆于目的载体中，转化E.coliJM109感受态细胞，LB/Amp/IPTG/X-gal平板筛选，随机挑选白色克隆用载体通用引物进行菌液PCR扩增和双酶切的初步鉴定后进行DNA测序，获得同时包含GJB2基因235de1C、299-300delAT、176del16bp、35de1G突变的突变质粒模板。先后通过反向PCR定点突变与重叠延伸产生特异性位点诱变方法对SLC26A4基因的野生模板质粒实施体外IVS7-2A>G、H723R定点突变后，再次转化E.coli JM109感受态细胞，同前筛选阳性克隆，测序挑选同时含有SLC26A4基因IVS7-2A>G、A2168G突变质粒模板。进一步设计分别与NSHL患者GJB2基因235de1C、299-300delAT、176del16bp、35de1G突变，SLC26A4基因IVS7-2A>G、H723R突变，mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T突变位点配对及三末端不配对的3’硫化修饰引物，构成野生检测引物与突变检测引物，对GJB2基因、mtDNA12S rRNA基因与SLC26A4基因野生质粒模板和突变质粒模板，进行高保真DNA聚合酶介导的双向引物延伸反应，利用凝胶成像系统对其PCR结果进行分析。并将其优化的PCR体系用于临床NSHL8个特点突变的筛查。结果GJB2与PDS分别为GJB2基因与SLC26A4基因的野生模板载体，其基因序列与Genebank来源一致。GJB2M与PDSM分别为GJB2与PDS的突变模板载体，GJB2M存在GJB2基因235de1C、299-300delAT、176del16bp和35de1G突变，PDSM存在SLC26A4基因IVS7-2A>G和A2168G突变。无论是突变位点的单靶检测，还是多靶同时检测，突变检测引物与突变模板配对时，特异性引物被延伸，有特异性PCR产物；与野生模板不配对时，特异性引物却不能被延伸，无特异性PCR产物。同样，特异性野生检测引物只有与野生模板匹配时得以特异性延伸，而与突变模板不匹配时则不能特异性延伸。突变敏感性分子开关对16例NSHL患者筛查GJB2基因235de1C、299-300del AT、176del16bp、35de1G突变，SLC26A4基因IVS7-2A>G、H723R突变，mtDNA12S rRNA基因C1494T、A1555G突变时，发现1例存在IVS7-2A>G突变，与测序结果一致。结论高保真DNA聚合酶偶联硫化修饰引物构成的突变敏感性分子开关能够对NSHL相关的mtDNA12S rRNA基因C1494T和A1555G突变，GJB2基因35delG、176del16bp、235delC和299-300delAT突变，SLC26A4基因IVS7-2A>G和2168A>G8个热点突变同时快速筛查，达到非此即彼的二元化效果。目的利用高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关，建立在同一PCR反应体系中对HCM患者bMHC基因Ala26Val、Arg663His、Arg723Gly、Gln893Lys、Ile736Thr、Glu924Lys突变，MYBPC3基因Ser236Gly、Glu258Lys、Arg346fs、Pro459fs、Lys814fs突变和TrpnI基因Arg145Trp热点突变可以同时进行快速筛查的技术平台，促进HCM的早期诊断与早期干预，评价HCM血缘亲属的发病风险，指导优生优育。方法相应基因DNA片段的重叠PCR产物克隆至pMD19-T载体，转化E.coli JM109感受态细胞，通过LB/Amp/IPTG/X-gal平板筛选白色克隆，载体通用引物对其进行菌液PCR扩增初步确定阳性克隆，并通过序列分析进行确证，得到三个野生模板质粒。多条定点突变引物5’末端磷酸化后，与相应的原始野生质粒模板进行退火、延伸、连接反应形成新的突变单链，再通过引物双向延伸反应获得突变双链DNA片段，突变双链DNA片段经适当的限制性内切酶双酶切、凝胶回收后克隆于目的载体中，LB/Amp/IPTG/X-gal平板筛选，随机挑选白色克隆用载体通用引物进行菌液PCR扩增和双酶切的初步鉴定后进行DNA测序鉴定，得到相应的三个突变质粒模板。进一步设计与bMHC基因Ala26Val、Arg663His、Arg723Gly、Gln893Lys、Ile736Thr、Glu924Lys，MYBPC3基因Ser236Gly、Glu258Lys、Arg346fs、Pro459fs、Lys814fs和Trpn I基因Arg145Trp热点突变位点配对及三末端不配对的3’硫化修饰引物，分别构成野生检测引物与突变检测引物，对相应的野生质粒模板和突变质粒模板，进行高保真DNA聚合酶介导的双向引物延伸反应，利用凝胶成像系统对其PCR结果进行分析。并将其优化的PCR体系用于临床HCM患者12个特点突变的筛查。结果MHC、MYB与MYT均为野生模板载体，其基因序列与Genebank来源一致。MHCM、MYBM与MYTM分别MHC、MYB与MYT载体的突变模板载体，MHCM存在bMHC基因Ala26Val、Arg663His、Arg723Gly、Gln893Lys、Ile736Thr、Glu924Lys突变，MYBM存在MYBPC3基因Ser236Gly、Glu258Lys、Arg346fs突变，MYTM存在MYBPC3基因Pro459fs、Lys814fs和Trpn I基因Arg145Trp突变。无论是突变位点的单靶检测，还是多靶同时检测，当突变检测引物与突变模板配对时，特异性引物被延伸，有特异性PCR产物；与野生模板不配对时，特异性引物却不能被延伸，无特异性PCR产物。同样，特异性野生检测引物只有与野生模板匹配时得以特异性延伸，而与突变模板不匹配时则不能特异性延伸。突变敏感性分子开关对8例临床HCM患者筛查未发现bMHC基因Ala26Val、Arg663His、Arg723Gly、Gln893Lys、Ile736Thr、Glu924Lys，MYBPC3基因Ser236Gly、Glu258Lys、Arg346fs、Pro459fs、Lys814fs和TrpnI基因Arg145Trp热点突变。结论高保真DNA聚合酶偶联硫化修饰引物构成的突变敏感性分子开关能够同时对HCM相关的bMHC基因Ala26Val、Arg663His、Arg723Gly、Ile736Thr、Gln893Lys、Glu924Lys突变，MYBPC基因Ser236Gly、Glu258Lys、Arg346fs、 Pro459fs、Lys814fs突变和TrpnI基因Arg145Trp突变12个热点突变进行辨认。