端粒是真核细胞染色体末端的天然结构,由TTAGGG端粒DNA重复序列和结合在端粒DNA序列上的shelterin端粒蛋白复合体组成。端粒保护染色体末端,是稳定基因组的重要结构。端粒酶复制延长端粒DNA,是维护端粒结构的重要因子。在人类,端粒酶维护端粒的调控与细胞衰老和肿瘤发生有密切关系,因此在抗肿瘤治疗和再生医学上有重大应用价值。鉴于端粒及端粒酶在细胞衰老、癌变及肿瘤治疗中的重大意义,2009年诺贝尔生理学或医学奖授予了在研究端粒结构及发现端粒酶的三位美国科学家。端粒酶是一种具有特殊逆转录酶活性的RNA-蛋白质复合体,核心成分是端粒酶逆转录酶TERT和端粒酶模版RNA TR。TERT逆转录TR为端粒TTAGGG DNA重复序列并添加到染色体末端,修复细胞分裂中由于末端不完整性复制问题造成染色体双链DNA末端端粒序列的丢失,保证染色体序列的完整性遗传。TERT是人类细胞端粒酶调控的限制成分。TERT基因在大多数正常人体细胞中不表达。因此正常人体细胞缺乏端粒酶活性,端粒DNA长度随细胞分裂次数增多逐渐缩短,最终引起细胞复制衰老。相反,癌变造成TERT重新表达,激活端粒酶稳定端粒长度,赋予肿瘤细胞永生化生长能力。因此TERT已被确定为重要抗肿瘤治疗靶标。近年越来越多研究揭示TERT在肿瘤中除发挥经典端粒酶复制延长端粒DNA的生物学功能外,还具有多种与其端粒酶催化活性无关的非经典生物学效应,在肿瘤细胞抗凋亡和促进肿瘤发生发展中同样发挥重要作用。但有关TERT非经典功能的分子机制目前仍很不清楚。本论文揭示出TERT在肿瘤端粒维持中除了已知的延长端粒DNA的端粒酶功能外,还存在一个与其端粒酶催化活性无关的端粒保护新功能,为靶向TERT抗肿瘤治疗研究发掘出了一个重要新靶点。研究取得的创新发现及意义主要体现在以下方面。一、揭示出TERT在肿瘤细胞中具有一种染色体末端保护新功能过RNAi抑制TERT表达的细胞生物学效应研究,发现抑制TERT表达特异性造成端粒酶阳性肿瘤细胞急性染色体末端DNA损伤反应活化,而抑制TERT表达并不影响依赖端粒酶稳定端粒永生化正常细胞的染色体末端保护机制,从而揭示出癌变使TERT在肿瘤细胞中发生一种染色体末端保护新功能。进一步通过对丧失端粒酶活性的TERT突变体DN-TERT的功能研究证明,TERT在肿瘤细胞中发挥的染色体末端保护功能与其端粒酶催化活性无关,从而揭示出TERT在肿瘤异常染色体端粒维护中体现出一种未知的端粒保护功能效应,对维持肿瘤细胞生存具有重要意义。二、证明抑制ATR介导的单链DNA损伤反应是TERT在肿瘤细胞发挥染色体末端保护的主要功能机制通过对ATM、ATR两个主要DNA损伤监测蛋白在TERT RNAi诱导肿瘤细胞染色体末端损伤中的作用分析,发现抑制ATR能够显著性消除TERT RNAi在肿瘤细胞诱导的染色体末端DNA损伤反应。从而证明TERT在染色体末端具有一种抑制ATR介导的单链DNA损伤反应活化的新生物学功能,是其在端粒发挥染色体末端保护的主要机制。并进一步揭示出ATR-ATM-Chk1-Chk2-P53是介导TERT RNAi诱导端粒酶阳性肿瘤细胞凋亡的主要信号途径,从而阐明了TERT在肿瘤细胞发挥抗凋亡非经典端粒酶功能的一个重要机理。三、证明TPP1-TERT相互作用是介导TERT在肿瘤发挥染色体末端保护功能的主要分子途径。抑制hTERT的表达在端粒部位引发了ATR-依赖的单链DNA损伤反应,表明在肿瘤细胞中TERT端粒3’突出的单链端粒DNA保护作用。Pot1/TPP1是已知在染色体末端保护端粒3’突出单链DNA的主要保护性蛋白,其中TPP1已被证明与TERT有相互作用,是肿瘤细胞端粒募集端粒酶的一条分子途径。但有关TPP1募集TERT在肿瘤端粒维持中的生物学意义并不清楚。而我们课题组最近发现了Pinx1-Pot1相互作用的一条新的端粒募集端粒酶分子途径,并通过RNAi抑制PinX1表达特异造成端粒酶阳性肿瘤细胞端粒缩短,但不引起肿瘤细胞急性端粒DNA损伤反应,证明了Pinx1-Pot1途径主要介导TERT在染色体末端发挥端粒酶延长端粒DNA的经典功能。在此基础上,本论文进一步研究了TPP1-TERT相互作用在肿瘤细胞中的端粒生物学意义。通过对丧失TERT相互作用的TPP1突变体在肿瘤和正常细胞染色体末端保护中的功能分析研究,证明丧失TERT相互作用使TPP1在肿瘤细胞中的染色体末端保护功能,但不影响其在依赖端粒酶稳定端粒的正常永生化细胞中的端粒保护功能。从而揭示出TPP1-TERT相互作用事介导TERT在肿瘤染色体末端发挥保护性功能的主要分子途径。四、鉴定出TERT N端1-230aa是其在肿瘤细胞中发挥染色体末端保护功能的最小功能单位。我们已经证明了TERT在肿瘤细胞中存在一种与其端粒酶催化活性无关的肿瘤染色体末端保护新功能,进一步对TERT在肿瘤细胞中发挥这一新功能的结构域进行鉴定。通过对TERT的系列缺失突变体的功能研究证明,TERT N端1-230aa是其在肿瘤细胞中发挥抑制ART染色体末端保护功能的最小独立功能结构域,对进一步开展TERT在肿瘤中保护染色体末端的结构-功能研究,发掘出靶向端粒酶抗肿瘤治疗新靶点奠定了重要基础。总结:一、本论文中揭示了端粒酶具有维持端粒稳定的功能,而这种功能不依赖于端粒酶活性。二、抑制hTERT表达后引起的端粒DNA损伤反应是由ATR-ATM-CHK2-P53-apopotosis这条信号通路传导的。三、我们发现hTERT N端1-230aa片段能与TPP1相互作用,且这个片段发挥稳定端粒的功能。