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研究背景：
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)作为一种全身弥漫性的病理状态,是大多数心血管疾病的病理基础。炎性反应细胞及其释放的产物已被认为是最主要的促动脉粥样硬化因素。近年来,越来越多的证据表明,ⅡA类分泌型磷脂酶A2(secretoryphospholipase A2 groupⅡA,sPLA2-ⅡA)作为一个重要的炎性反应介质,在动脉粥样硬化的发生和发展中起到了重要的作用。目前关于sPLA2-ⅡA的研究多集中在对巨噬细胞的影响以及与脂代谢的关系上,对内皮细胞的研究较少。而内皮功能紊乱是动脉粥样硬化发生的最初环节,明确sPLA2-ⅡA的致炎效应对血管内皮功能的影响,探索其发挥作用的机制,有助于进一步了解动脉粥样硬化的发生发展机制,并有助于探索动脉粥样硬化过程中的治疗新靶点。
研究目的：
1.通过测定与分析多种内皮细胞粘附分子和分泌因子的表达水平,包括细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule—1,ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1)、一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase,eNOS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)和内皮素-1(endothelin,ET—1),从不同角度了解sPLA2-ⅡA刺激对血管内皮功能的影响。
2.通过观察4-BPB(4-bromophennacyl bromide,sPLA2-ⅡA水解作用的抑制剂)对sPLA2-ⅡA诱导的内皮功能影响的变化,以了解sPLA2-ⅡA的水解作用是否参与了损伤内皮细胞的过程。
3.通过观察PD98059(ERK选择性抑制剂)、SP600125(JNK选择性抑制剂)、SB203580(p38选择性抑制剂)对sPLA2-ⅡA诱导的内皮功能影响的变化,以了解MAPKinase信号通路是否参与了sPLA2-ⅡA对内皮细胞的影响。
4.通过观察Bay11-7085(NF—kB选择性抑制剂)对sPLA2-ⅡA诱导的内皮功能影响的变化,以了解NF—kB是否参与了sPLA2-ⅡA对内皮细胞的影响。
研究方法:
1.体外分离培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)。
2.不同浓度的sPLA2-ⅡA体外刺激HUVEC细胞,设置3个浓度(0.01、0.1、1μg/ml),以未加任何药物刺激培养的细胞作为空白对照,以10ng/ml TNF—α刺激培养的细胞作为阳性对照,利用试剂盒检测内皮细胞上清的一氧化氮浓度,并利用荧光定量逆转录多聚酶链反应(Real-Time PCR)方法分析一氧化氮合酶(eNOS)、内皮素-1(endothelin,ET-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管粘附分子-1(VCAM—1)的mRNA表达水平的变化,用Western Blot法分析eNOS、ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表达水平变化,用ELISA方法分析ET—1在蛋白水平的表达变化。
3.采用体外分离培养HUVEC的方法,以1μg/mL sPLA2-ⅡA、10μ mol/L4-BPB单独或联合刺激内皮细胞,利用试剂盒检测内皮细胞上清的一氧化氮浓度,并通过Real-Time PCR检测分析eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1转录水平的变化,用Western Blot法分析eNOS、ICAM-1、VCAM-I在蛋白水平的表达变化,用ELISA方法分析ET-1在蛋白水平的表达变化。
4.以1μg/ml sPLA2-ⅡA、1μmol/LPD98059或SP600125或SB203580单独或联合刺激内皮细胞,利用试剂盒检测内皮细胞上清的一氧化氮浓度,并通过Real-Time PCR检测分析eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1转录水平的变化,用Western Blot法分析eNOS、ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表达变化,用ELISA方法分析ET-1在蛋白水平的表达变化。
5.以1μg/ml sPLA2-ⅡA、1μmol/LBay11-7085单独或联合刺激内皮细胞,利用试剂盒检测内皮细胞上清的一氧化氮浓度,并通过Real-Time PCR检测分析eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1转录水平的变化,用Western Blot法分析eNOS、ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表达变化,用ELISA方法分析ET-1在蛋白水平的表达变化。
6.用SPSS13.0软件进行数据统计分析,组间比较用单因素方差分析(one-wayANOvA)及独立样本t检验,多重比较采用LSD和SNK法。p<0.05为有统计学意义。
研究结果:
1.0.1μ g/ml和1μ g/ml的sPLA2-ⅡA均能诱导脐静脉内皮细胞ICAM-1、VCAM-1mRNA和蛋白水平的表达(p<0.05),且诱导作用呈浓度依赖性(p<0.05)。
2.0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μ g/ml的sPLA2-ⅡA均能诱导脐静脉内皮细胞ET-1mRNA和蛋白的表达,并且诱导作用呈浓度依赖性(p<0.05)。1μ g/ml sPLA2-ⅡA能明显抑制脐静脉内皮细胞eNOS mRNA的表达(p<0.01),各浓度的sPLA2-ⅡA对eNOS蛋白表达的影响不明显；0.01μ g/ml、0.1μg/ml和1μg/ml的sPLA2-ⅡA均能明显抑制内皮细胞NO的生成(p<0.01),且呈浓度依赖性(p<0.05)。
3.4-BPB干预组细胞的ICAM-1、VCAM-1 mRNA和蛋白的表达较1μg/ml sPLA2-ⅡA单独刺激组显著降低(p<0.01,p<0.05)。4-BPB处理明显减弱1μg/ml sPLA2—ⅡA调节的ET—1 mRNA和蛋白的表达(p<0.01)；4-BPB处理也明显减弱1μg/mlsPLA2-ⅡA调节的eNOS mRNA的表达(p<0.05),减弱sPLA2-ⅡA对NO生产的抑制作用(p<0.01)。
4.PD98059干预组细胞的ICAM-1、VCAM-1、ET-1蛋白的表达水平较1μg/mlsPLA2-ⅡA单独刺激组显著降低(p<0.01),PD98059处理也明显减弱1μg/mlsPLA2-ⅡA抑制NO生成的作用(p<0.01)。
5.SP600125干预组细胞的ET—1蛋白的表达水平较1μg/ml sPLA2-ⅡA单独刺激组显著降低(p<0.01),SP600125处理也明显减弱1μg/ml sPLA2-ⅡA抑制NO生成的作用(p<0.01)；但SP600125对1μg/ml sPLA2-ⅡA诱导ICAM-1、VCAM-1蛋白表达增加的影响不显著(P>0.05)。
6.SB203580对1μg/ml sPLA2-ⅡA诱导ICAM-1、VCAM-1、ET—1蛋白表达增加的影响不显著(P>0.05),对1μg/ml sPLA2-ⅡA抑制NO生成的影响也不显著(P>0.05)。
7.Bay11-7085干预组细胞的ICAM-1、VCAM-1、ET-1蛋白的表达水平较1μg/mlsPLA2-ⅡA单独刺激组显著降低(ICAM-1:p<0.01；VCAM-1:p<0.05；ET-1:p<0.01),但Bay11-7085对1μg/ml sPLA2-ⅡA抑制NO生成的影响不明显(P>0.05)。
结论:
1.sPLA2-ⅡA能剂量依赖性地影响内皮细胞功能,促进内皮细胞粘附分子和ET-1的表达,并抑制N0的生成。
2.sPLA2-ⅡA的水解作用参与其对内皮细胞的损伤过程。
3.sPLA2-ⅡA主要通过MAPKinase ERK和NF-kB通路上调内皮细胞黏附因子的表达,从而影响内皮细胞黏附功能。
4.sPLA2-ⅡA主要通过MAPKinase的ERK和JNK通路影响内皮细胞ET-1和NO的生成,从而调节血管舒缩状态。NF-kB也在上调ET-1表达中起到重要作用。