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背景：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,已居女性恶性肿瘤发病率的首位。复发和转移是导致恶性肿瘤治疗失败及引起患者死亡的首要原因。随着干细胞生物学的进步和肿瘤发病机制研究的不断深入,越来越多证据表明,是肿瘤组织中具有干细胞样性质的细胞,即肿瘤干细胞,决定了肿瘤的复发和转移。机体存在免疫,考虑为乳腺癌干细胞可能是基于免疫逃逸导致了乳腺癌的复发和转移。中医认为肿瘤转移机制在于正气内虚、邪毒未尽,应用扶正祛邪毒治疗方法预防乳腺癌术后复发转移。既然肿瘤干细胞是肿瘤复发转移的先决条件,而中药扶正祛毒治法可以一定程度上预防乳腺癌复发转移,推测中药扶正祛毒方法可能是干预了乳腺癌干细胞从而预防了乳腺癌复发和转移。目的：乳腺癌干细胞基于NK的免疫逃逸导致肺转移的体内研究,并研究中药扶正祛毒方干预乳腺癌干细胞引起肺转移的作用和机制。方法：内容一小鼠乳腺癌干细胞4T1-CSC基于NK免疫逃逸导致肺转移的体内研究1悬浮球状培养分离和富集4T1-CSC,并用流式方法检测了CD24-/lowCD44+含量,动物成瘤实验验证4T1-CSC。24T1-CSC高效肺转移的作用和机制：4T1-CSC和4T1引起小鼠乳腺癌肺转移的体内对比,分别予BALB/c小鼠尾静脉接种105/mL4T1-CSC和4T1,21天取材,对比两种细胞肺转移能力,解剖显微镜下计算肺转移结节数,用ELISA方法测血中TGF-β1及流式方法检测血中NKG2D。内容二中药扶正祛毒方预防乳腺癌肺转移的作用和机制1中药扶正祛毒方制备,黄芪10g,天冬10g,苦参10g,姜黄10g,浙贝母10g,制成膏剂：成膏率235g/750g。按体重折算成小鼠低、中、高剂量。2扶正祛毒方给药时间及剂量的摸索：尾静脉接种4T1-luc建立小鼠实验性乳腺癌肺转移模型观察扶正祛毒方作用,50只BALB/c,将40只已接种小鼠随机分成4组,每组10只,定为低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组及模型组。另外10只为空白组。随机取5只,分别在接种的第5、9、13天三个时间点观察肺转移情况。第21天取材,解剖显微镜下计算肺转移结节数目。3扶正祛毒方预防乳腺癌肺转移的作用和机制：尾静脉接种4T1-CSC建立小鼠实验性乳腺癌肺转移模型观察扶正祛毒方作用及机制。40雌性BALB/c小鼠,30只小鼠随机分为三组,20倍中药组、30倍中药组及模型组。另10只为空白对照组。中药组接种前3天予以中药灌胃。模型组予以等量去离子水灌胃。干预3天后,取第3代无血清培养的第6天的4T1-CSC,消化后PBS稀释至1×106细胞/mL,取0.1mL细胞悬液通过尾静脉接种于BALB/c小鼠,接种于中药组及模型组(操作者单盲),每只BALB/c小鼠尾静脉接种细胞数为1×105个4T1-CSC细胞。培养21天后取材,解剖显微镜下计算肺转移结节数,用ELISA方法测血中TGF-β1及流式方法检测血中NKG2D。并用免疫组化方法检测肺组织中MMP-9、VEGF及u-PA含量。结果：内容一小鼠乳腺癌干细胞4T1-CSC基于NK免疫逃逸导致肺转移的体内研究1悬浮球状培养分离和富集4T1-CSC,无血清悬浮球状培养4T1,3天可见成球,3天半换液,球体逐渐增大,6天传代。传代后第3天又可成球,同前。取第3代第6天的细胞球消化后做实验。通过无血清悬浮球状培养培养细胞球,其CD24-/1owCD44+表面标记检测结果为(82.56±4.13)%。而4T1的CD24y-/lowCD44+表面标记检测结果为(0.11±0.05)%。动物成瘤实验鉴定4T1-CSC, BALB/c小鼠左侧乳垫接种4T1-CSC,右侧乳垫接种等量4T1,均为104／只数量级,接种第9天,454T1-CSC侧成瘤,0/54T1侧未成瘤。103数量级,接种第18天4/5 CSC侧成瘤,0/54T1侧未成瘤。从而鉴定4T1-CSC。24T1-CSC高效肺转移的作用和机制：4T1-CSC和4T1引起小鼠乳腺癌肺转移的体内对比,检验方法为Mann-Whitney,即两组独立样本的秩和检验,4T1-CSC组肺转移结节多于4T1组,P=0.009<0.05,差异有统计学意义。4T1-CSC组CD314较4T1组CD314下降,P=0.005,差异有统计学意义。CSC组TGF-β1较4T1组TGF-β1下降,P=0.016<0.05,差异有统计学意义。内容二中药扶正祛毒方预防乳腺癌肺转移的作用和机制1中药扶正祛毒方制备。2扶正祛毒方给药时间及剂量的摸索：尾静脉接种4T1-luc建立小鼠实验性乳腺癌肺转移模型观察扶正祛毒方作用：接种第5天,小动物活体成像显示各组肺转移差异无统计学意义(P=0.161>0.05)；接种第9天,小动物活体成像显示高剂量中药组较模型组肺转移减少,差异有统计学意义(P=0.017<0.05)；接种第13天,小动物活体成像显示高剂量中药组较模型组肺转移减少,差异有统计学意义(P=0.003<0.05)；第21天取材,计算肺转移数目,各剂量中药组较模型组肺转移差异无统计学意义(P>0.05)。但高剂量中药组有下降趋势。选取高剂量中药组(20倍中药组)做下一步研究。3扶正祛毒方预防乳腺癌肺转移的作用和机制：20倍中药组、30倍中药组较模型组肺转移结节减少,两个P=0.001<0.05差异有统计学意义。30倍中药组较20倍中药组肺转移结节差异无统计学意义,P=0.737>0.05。选取20倍中药组做药物机制研究,结果20倍中药组、模型组及空白组血中CD314差异无统计学意义(P=0.330>0.05)。20倍中药组较模型组TGF-β1差异无统计学意义(P=0.997>0.05)。免疫组化显示中药组肺组织中MMP-9、VEGF及u-PA含量少于模型组。结论：14T1-CSC具有高效肺转移特性,原因可能为4T1-CSC基于NK免疫逃逸导致高效肺转移。2中药扶正祛毒方可以干预4T1-CSC引起的肺转移,作用机制可能与NK杀伤能力无关,可能与中药扶正祛毒方减少MMP-9、VEGF及u-PA含量有关。