临床应用PRP制备方法的比较研究

来源 :大连医科大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:solarshu
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目的:用对兔脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)增殖的影响来验证Tubex和传统二次离心法制备自体富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)各自生物学效应,来探讨一种安全、快速、高效制备PRP的方法。方法:1选用新西兰大白兔,雄性,取兔附睾部区脂肪垫,Ⅰ型胶原酶消化法培养兔ADSCs,并观察细胞形态特征。2选取P4第4代ADSCs进行成脂、成骨诱导分化及染色来鉴定ADSCs。3PRP的制备采用兔心脏穿刺抽血,二次离心的方法,并行血小板计数及血小板回收率的计算。4将第4代细胞分为空白组(完全培养基180μl+单纯DMEM培养基20μl);对照组(细胞180ul+单纯DMEM培养基20ul)、全血组(细胞180ul+全血血浆20ul)、Tubex制备的PRP组(细胞180ul+PRP20ul)、传统二次离心法制备的PRP组(细胞180ul+PRP20ul)。采用CCK-8法(Cell-Counting Kit-8)检测不同作用时间(24h、48h、72h)各组对ADSCs增殖活动的影响。5将全血、Tubex制备的PRP及传统二次离心法制备的PRP采用双抗夹心法(ELISA)检测其中血小板源性生长因子(platelet derived growth facto,PDGF-AB)的浓度。结果:1原代细胞提取后镜下观其形状为圆形、大小不等。培养24小时后可见有少量的细胞贴壁形状为不规则细长型,可有像伪足一样的突起。3天后镜下观大量细胞已经贴壁生长,形状为比较细的长梭形,细胞开始增大并可见核分裂相,梭形细胞逐渐增多。5天后细胞的密度明显增加,呈现出团簇状、并向各个方向伸展形成集落,大小不一,多为长梭形。细胞融合在80%-90%时即可胰酶传代。2成骨诱导三周茜素红染色呈阳性,成脂诱导两周油红O染色呈阳性,3全血血小板计数为(260.2±96.8)×109/L;传统二次离心法提取的PRP血小板计数为(1508.8±557.0)×109/L; Tubex提取的PRP血小板计数为(3140.0±291.5)×109/L。Tubex制备的PRP血小板计数是全血的12.06倍,是传统二次离心法制备的PRP的2.08倍4按血小板回收率计算公式计算Tubex制备的PRP和传统二次离心法制备的PRP的回收率,结果:Tubex制备的PRP血小板回收率为82.86%,传统方法回收率为72.54%。5CCK-8法显示Tubex提取的PRP与传统二次离心法提取的PRP对ADSCs有明显的增殖作用。Tubex提取的PRP组在与传统组比较,其差异有显著地统计学意义(P<0.01)。6PRP中血小板源性生长因子PDGF-AB的浓度采用ELISA法检测,结果显示:Tubex制备的PRP中PDGF-AB的浓度明显高于传统二次离心法制备的PRP及全血PDGF-AB的浓度,其差异均有显著地统计学意义(P<0.01)。结论:1提取兔附睾部区脂肪垫分离培养的细胞,经诱导分化并染色鉴定证实为ADSCs。2通过Tubex和传统二次离心法成功提取兔PRP,经血小板计数及ELISA法检测其中血小板生长因子PDGF-AB的浓度,证实Tubex是一种更加快速、安全、高效制备PRP的方法。3Tubex制备的PRP与传统方法制备的PRP相比,能够更加高效,快速的促进ADSCs的增殖。
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