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目的:
本课题组前期研究证明,Toll样受体4(TLR4)及相关分子-髓样分化因子88(MyD88)、髓样分化蛋白-2(MD-2)参与抗β2糖蛋白Ⅰ抗体/β2糖蛋白Ⅰ(anti-β2GPI/β2GPI)复合物诱导人单核细胞株THP-1表达组织因子(TF),且部分依赖膜联蛋白Ⅱ(ANX2),成为抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)血栓形成的机制之一。本文着重探讨TLR4信号通路中另一分子家族-丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)在anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF中的作用及其信号转导机制。
方法:
1、利用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞TF mRNA的表达,采用试剂盒检测细胞TF活性。
2、Western bloting检测anti-β2GPI/β2GPI复合物刺激THP-1细胞MAPKs(p38、ERK1/2及JNK1/2)表达及其磷酸化情况,并检测anti-β2GPI/β2GPI刺激的时效性和特异性。
3、采用TLR4抑制剂TAK-242预处理THP-1细胞,观察其对anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化的干预作用。
4、采用IRAKs抑制剂sc-204013预处理THP-1细胞,观察其对anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化的干预作用。
5、采用MAPKs抑制剂SB203580(p38抑制剂)、U0126(ERK1/2抑制剂)、SP600125(JNK1/2抑制剂)预处理THP-1细胞,观察其对anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF的干预作用。
结果:
1、Anti-β2GPI/β2GPI复合物(100μg/ml)能显著增加THP-1细胞TF mRNA水平及TF活性(与未刺激对照比较p＜0.05)
2、Anti-β2GPI/β2GPI复合物(100μg/ml)能显著增加THP-1细胞p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化水平,并显示时间效应,于刺激30 min时磷酸化最强(与未刺激比较p＜0.05)。Anti-β2GPI/β2GPI复合物(100μg/ml)和LPS(500 ng/ml)对THP-1细胞MAPKs磷酸化的刺激效应一致。
3、TLR4抑制剂TAK-242(5μM)能够显著降低anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导的p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化水平(与未经TAK-242处理组比较p＜0.05)。
4、IRAKs抑制剂sc-204013(50μM)能够降低anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导的p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化水平(与未经sc-204013处理组比较p＜0.05)
5、p38、ERK1/2及JNK1/2抑制剂[SB203580(10μM)、U0126(5μM)、SP600125(90nM)]分别单独预处理THP-1细胞,只能部分抑制anti-β2GPI/β2GPI复合物对TF表达的刺激效应(与未经抑制剂处理组比较p＜0.05);而任意二种抑制剂组合[SB203580(10μM)/U0126(5μM)、U0126(5μM)/SP600125(90nM)、SB203580(10μM)/SP600125(90nM)]预处理细胞,可以显著抑制anti-β2GPI/β2GPI复合物刺激的TF表达(与未经抑制剂处理组比较p＜0.01)。
结论:
1、自身抗体/抗原复合物(anti-β2GPI/β2GPI)刺激单核细胞株THP-1表达TF,细胞内的重要信号分子家族MAPKs(p38、ERK1/2及JNK1/2)同时发生磷酸化反应。
2、在anti-β2GPI/β2GPI复合物刺激细胞表达TF所涉及的信号转导通路中,细胞表面TLR4及其信号通路分子IRAKs作为MAPKs的上游分子参与调控作用.提示TLR4-IRAKs-MAPKs通路可作为抗磷脂综合征(APS)血栓形成的防治靶点。
3、在anti-β2GPI/β2GPI复合物刺激细胞表达TF的过程中,三种MAPKs分子均发挥重要作用,并且相互之间的级联反应存在着复杂的协同作用,这为APS血栓形成的防治提供了新思路。